Tests de viabilité et de prolifération cellulaires
- Tests de prolifération d'après la synthèse d'ADN
- Tests de prolifération métaboliques
- Tests de viabilité cellulaire par luminescence
- Tests de prolifération avec colorant fluorescent
- Culture cellulaire 3D : triple coloration des cellules vivantes/mortes/totales
- Comptage cellulaire au bleu trypan
Introduction
Les tests qui permettent de mesurer la prolifération, la viabilité et la toxicité cellulaires servent généralement à surveiller la réponse et la santé des cellules en culture après l'administration de différents stimuli. Le choix de la bonne méthodologie dépend du nombre et du type de cellules à évaluer ainsi que du résultat attendu. Les tests de prolifération cellulaire peuvent suivre l'évolution dans le temps du nombre de cellules, le nombre de divisions cellulaires, l'activité métabolique ou la synthèse d'ADN. Le comptage des cellules avec des colorants de viabilité comme le bleu trypan ou la calcéine-AM permet de connaître la vitesse de prolifération ainsi que le pourcentage de cellules viables.
Tableau récapitulatif des tests de viabilité et de prolifération cellulaires
Tests de prolifération d'après la synthèse d'ADN
Test de prolifération cellulaire à la BrdU
Pour étudier la prolifération cellulaire, il est possible de surveiller l'incorporation d'un isotope radioactif, la [3H]-thymidine, dans l'ADN cellulaire, puis d'effectuer une autoradiographie. La thymidine peut également être remplacée par la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU). L'utilisation d'un anticorps monoclonal dirigé contre la BrdU et d'un anticorps secondaire conjugué à une enzyme ou à un fluorochrome permet de détecter facilement les cellules qui ont incorporé la BrdU dans leur ADN.
Figure 1.A) Coloration à la BrdU des cellules en prolifération dans l'œil d'un embryon de poulet au stade E4. B) Validation de l'anticorps anti-BrdU par traitement à la camptothécine. Après le traitement de cellules Jurkat à la camptothécine, qui est un agent d'arrêt de cycle cellulaire, les cellules circulantes sont bloquées en transition G1/S.
Tests de prolifération à l'EdU
Les tests de prolifération à l'EdU Baseclick offrent un moyen efficace de détecter l'ADN en réplication par fluorescence. Après avoir été ajouté à des cellules vivantes, le nucléoside modifié 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) s'intègre dans l'ADN en réplication. Une réaction de chimie clic catalysée par le cuivre permet de fixer rapidement des sondes fluorescentes à l'EdU. Il est ainsi possible d'effectuer une surveillance quantitative des cellules en prolifération. Ces tests sont déclinés en différents formats conçus pour la microscopie, la cytométrie en flux, le criblage à haut débit et les expériences in vivo. Il existe quatre sondes fluorescentes différentes (pics d'excitation de 488 nm, 555 nm, 594 nm et 647 nm), ce qui offre des possibilités de multiplexage avec d'autres sondes fluorescentes.
Figure 2.Les kits de test de prolifération cellulaire EdU-Click incorporent l'EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) pendant la synthèse active de l'ADN, puis la mesurent au moyen d'une méthode de détection par fluorescence faisant appel à la chimie clic.
Tests de prolifération métaboliques
Les tests mesurant l'activité métabolique sont adaptés à l'analyse de la prolifération, de la viabilité et de la toxicité cellulaires. La réduction des sels de tétrazolium (MTT, XTT, WST-1) en formazan coloré ou la bioréduction de la résazurine est limitée aux cellules métaboliquement actives. L'activité métabolique augmente dans les cellules en prolifération active, mais diminue dans les cellules exposées à des toxines.
Tests de prolifération cellulaire au MTT
Le MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium ; bleu de thiazolyle] est un sel de tétrazolium soluble dans l'eau qui forme une solution jaunâtre lorsqu'il est dilué dans des milieux ou des solutions salines ne contenant pas de rouge de phénol. Le MTT dissous se convertit en formazan violet insoluble après clivage du cycle tétrazolium par des déshydrogénases. Ce formazan insoluble dans l'eau peut être solubilisé dans l'isopropanol ou d'autres solvants ; la substance dissoute peut alors être dosée par spectrophotométrie en mesurant l'absorbance en fonction de la concentration du colorant converti.
Tests de prolifération cellulaire au XTT
Contrairement au MTT, le produit de clivage du XTT est soluble dans l'eau ; aucune étape de solubilisation n'est donc nécessaire. Le sel de tétrazolium XTT est clivé en formazan par un mécanisme cellulaire complexe. Cette bioréduction se produit uniquement dans les cellules viables et est liée à la production glycolytique de NAD(P)H. La quantité de colorant formazan formée est directement corrélée au nombre de cellules métaboliquement actives présentes dans la culture.
Tests de prolifération cellulaire au WST-1
Le WST-1 est un sel de tétrazolium stable qui est clivé en formazan soluble par un mécanisme cellulaire complexe qui se produit essentiellement au niveau de la surface des cellules. Cette bioréduction dépend en grande partie de la production glycolytique de NAD(P)H dans les cellules viables. La quantité de colorant formazan formée est directement corrélée au nombre de cellules métaboliquement actives présentes dans la culture.
Guide technique : test de viabilité et de prolifération cellulaires au WST-1. Protocoles, foire aux questions et résolution des problèmes
Figure 3.Le test au MTT est un dosage colorimétrique qui permet d'évaluer la prolifération cellulaire d'après l'activité métabolique. Les oxydoréductases cellulaires dépendantes du NAD(P)H reflètent le nombre de cellules viables présentes. Ces enzymes sont capables de réduire le colorant tétrazolium jaune MTT [bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium] en son formazan insoluble qui est de couleur violette.
Tests de viabilité cellulaire par luminescence
Étant donné que l'ATP est un indicateur des cellules métaboliquement actives, il est possible d'évaluer le nombre de cellules viables sur la base de la quantité d'ATP disponible. Le test de viabilité cellulaire par ATP-métrie (luciférase) est un dosage homogène ultrasensible qui permet de doser la quantité d'ATP présente dans les cultures cellulaires. Ce kit utilise la luciférase de luciole pour oxyder la D-luciférine, puis l'émission de lumière résultante pour évaluer la quantité d'ATP disponible dans les cultures cellulaires. Ce test sensible s'effectue en ajoutant le cocktail de détection de l'ATP en une seule fois directement dans les cellules cultivées dans un milieu supplémenté en sérum. La procédure ne nécessite ni lavage des cellules, ni élimination du milieu, ni pipetages multiples. Ce kit est assez sensible pour détecter une seule cellule ou 0,01 picomole d'ATP. Le signal émis est linéaire sur six ordres de grandeur. En établissant un lien entre la quantité d'ATP et le nombre de cellules viables, ce test trouve une utilité dans de nombreuses applications, de la détermination du nombre de cellules viables à la mesure de la prolifération cellulaire en passant par l'évaluation de la cytotoxicité.
Figure 4.Test de viabilité cellulaire par ATP-métrie (luciférase). L'oxydation de la D-luciférine par la luciférase de luciole en présence d'ATP et l'émission de lumière qui en résulte permettent d'évaluer la quantité d'ATP disponible, et donc, le nombre de cellules ainsi que leur viabilité.
Tests de prolifération avec colorant fluorescent
Marquage au CFSE
Le marquage à l'ester succinimidylique de diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine (CFSE) est couramment utilisé pour mesurer le nombre de divisions effectuées par une population de cellules donnée. Après avoir pénétré dans la cellule, le CFSE est clivé par les estérases intracellulaires pour former le composé fluorescent, tandis que le groupement ester succinimidylique réagit de manière covalente avec les amines primaires des protéines intracellulaires. L'intensité de la fluorescence de chaque cellule fille étant divisée par deux à chaque division, le nombre de divisions cellulaires est facile à détecter par cytométrie en flux. Le CFSE est très utilisé pour mesurer la prolifération des lymphocytes, notamment des lymphocytes T.
Double coloration des cellules vivantes/mortes
La double coloration des cellules vivantes/mortes permet de détecter simultanément par fluorescence les cellules viables et les cellules mortes. La calcéine-AM est un colorant hautement lipophile et membrane-perméable. Bien que la calcéine-AM ne soit pas elle-même une molécule fluorescente, la calcéine qui résulte du clivage de son groupement AM par une estérase dans les cellules viables émet une forte fluorescence verte (λex = 490 nm, λem = 515 nm). La calcéine-AM ne colore donc que les cellules viables. À l'inverse, l'iodure de propidium (PI) est un colorant nucléaire qui est incapable de traverser la membrane des cellules viables. Il atteint le noyau en traversant la membrane abîmée des cellules mortes et s'intercale dans la double hélice de l'ADN pour émettre une fluorescence rouge (λex = 535 nm, λem = 617 nm). Étant donné que la calcéine et l'ADN-PI sont tous excitables par une lumière de 490 nm, il est possible de visualiser simultanément les cellules viables et les cellules mortes au microscope à fluorescence, avec une seule et même longueur d'onde d'excitation.
Figure 5.Double coloration des cellules vivantes/mortes
Culture cellulaire 3D : triple coloration des cellules vivantes/mortes/totales
Le kit de test de viabilité cellulaire par imagerie est un dosage à trois couleurs qui peut être utilisés sur des cultures cellulaires en 2D ou en 3D pour la coloration fluorescente simultanée des cellules viables (calcéine-AM), mortes (iodure de propidium) et totales (Hoechst 33342).
- La calcéine-AM émet une fluorescence verte en réponse à la fixation du calcium, grâce à l'activité estérase spécifique des cellules viables métaboliquement actives.
- L'iodure de propidium est un colorant nucléaire qui est exclu par la membrane des cellules vivantes, mais qui traverse la membrane endommagée des cellules mortes, s'intercalant dans l'ADN pour émettre une fluorescence rouge intense.
- Le Hoechst 33342 est un colorant de l'ADN qui présente une faible cytotoxicité. Il émet une fluorescence bleue et est utilisé comme indicateur du nombre total de cellules.
Comptage cellulaire au bleu trypan
Le bleu trypan fait partie des colorants dont l'usage est recommandé dans les tests d'exclusion de colorant pour le comptage des cellules viables. Le principe est le suivant : les cellules vivantes (viables) ne fixent pas le colorant bleu, contrairement aux cellules mortes (non viables) ; la viabilité cellulaire peut donc être calculée par le rapport entre le nombre total de cellules vivantes et le nombre total de cellules (vivantes et mortes). La coloration permet par ailleurs de mieux visualiser la morphologie globale des cellules.
REMARQUE : Le bleu trypan présente une plus grande affinité pour les protéines sériques que pour les protéines cellulaires. Si l'arrière-plan est trop foncé en raison de la présence de sérum dans la matrice, les cellules doivent être centrifugées et le culot remis en suspension dans une solution saline ou un milieu sans protéines avant le comptage.
Références
Pour continuer à lire, veuillez vous connecter à votre compte ou en créer un.
Vous n'avez pas de compte ?