Protokolle zur Bakterientransformation

Transformation ist ein Schlüsselprozess in der molekularen Klonierung, in dem mehrere Kopien rekombinanter DNA-Moleküle hergestellt werden. Die Fähigkeit, freies, extrazelluläres genetisches Material aufzunehmen, ist die Voraussetzung dafür, dass bakteriell kompetente Zellen transformiert werden können. Ziel ist es, die Replikation der Zielsequenz eines rekombinanten Plasmids zu erhalten.

Abbildung 1. Transformation

Vor dem Beginn der Transformation:

• LB-Agarplatten vorbereiten und absetzen lassen. Bei Verwendung vorgegossener Platten sicherstellen, dass die Platten auf 37 °C erwärmt sind.
• Abhängig vom in der Plasmid-DNA vorhandenen Antibiotikamarker das entsprechende Antibiotikum in den LB-Agar einfügen.
• Wenn ein Blau/Weiß-Screening auf Rekombinanten erforderlich ist, 1 mM IPTG, 300 µg/ml S-Gal oder 40 µg/ml X-Gal und 500 µg/ml Ammoniumeisencitrat in den LB-Agar geben.
• Bei Verwendung elektrokompetenter Zellen die Elektroporationskammer auf Eis legen.
• Das Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
• Das sterile SOC-Medium auf Raumtemperatur (oder 20–25 °C im Wasserbad) erwärmen.

Protokoll für die Transformation bei Verwendung chemisch kompetenter Zellen

Erforderliche, aber nicht im Lieferumfang enthaltene Materialien:

Reagenzien	Ausrüstung
SOC-Medium (Produkt-Nr. S1797)	Schüttelinkubator (37 °C)
LB-Agar EZMix™ (Produkt-Nr. L7533)	Inkubationsschrank (37 °C)
Auswahl des geeigneten Antibiotikums	Erwärmtes Wasserbad (37 °C)
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) (Produkt-Nr. I6758)	15-ml-Polypropylen-Kulturröhrchen (steril)
X-Gal (Produkt-Nr. B9146)	Kulturschalen
S-Gal™ (Produkt-Nr. S9811)	Lazy-L sterile Spreader (Produkt-Nr. Z376779)
Ammoniumeisencitrat (Produkt-Nr. F5879)

Standard-Transformationsprotokoll

1. Die erforderliche Anzahl Röhrchen aus dem -70 °C Gefrierschrank auf feuchtes Eis überführen. Falls gewünscht, ein zusätzliches Röhrchen für Kontroll-DNA beifügen.
2. Die Zellen 5 Minuten auftauen lassen. Mehrmals vorsichtig auf die Röhrchen klopfen, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten.
   1. Für die Kontrolle: 1 µl (10 ng) pUC19 Kontroll-DNA in ein Röhrchen geben. Durch leichtes Klopfen mischen und auf Eis legen.
   2. 1 ng bis 50 ng aufgereinigte Plasmid-DNA direkt zu den Zellen in den übrigen Röhrchen geben. Durch leichtes Klopfen mischen und auf Eis legen.
3. Die Zellen auf Eis 30 Minuten inkubieren
4. Die Zellen für genau 45 Sekunden in ein 37 °C warmes Wasserbad überführen
5. Die Zellen für 2 Minuten auf Eis legen
6. In jedes Röhrchen SOC-Medium geben. Die Zellen in sterile Polypropylenröhrchen überführen und die Deckel lösen, um die Belüftung der Kulturen zu erleichtern.
7. Die Zellen im Schüttelinkubator (225–250 rpm) bei 37 °C eine Stunde inkubieren
8. 10–100 µl jeder transformierten Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit selektivem Antibiotikum pipettieren und mit einem sterilen Spreader verteilen
9. Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren
10. Kolonie(n) auswählen und bei Bedarf kultivieren.
11. Die Plasmid-DNA aus jeder Kultur isolieren.
12. Die bevorzugten Klone kultivieren.
13. Die Plasmid-DNA mit Restriktionsenzymen verdauen; durch Gelelektrophorese trennen.

Protokoll für die Transformation mit elektrokompetenten Zellen

Erforderliche, aber nicht im Lieferumfang enthaltene Materialien:

Reagenzien	Ausrüstung
SOC-Medium (Produkt-Nr. S1797)	Schüttelinkubator (37 °C)
LB-Agar EZMix™ (Produkt-Nr. L7533)	Inkubationsschrank (37 °C)
Auswahl des geeigneten Antibiotikums	Erwärmtes Wasserbad (37 °C)
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) (Produkt-Nr. I6758)	15-ml-Polypropylen-Kulturröhrchen (steril)
X-Gal (Produkt-Nr. B9146)	Kulturschalen
S-Gal™ (Produkt-Nr. S9811)	Lazy-L sterile Spreader (Produkt-Nr. Z376779)
Ammoniumeisencitrat (Produkt-Nr. F5879)	Kulturschalen

Standard-Transformationsprotokoll

1. Die erforderliche Anzahl Röhrchen aus dem -70 °C Gefrierschrank auf feuchtes Eis überführen. Falls gewünscht, ein zusätzliches Röhrchen für Kontroll-DNA hinzufügen.
2. Die Zellen 5 Minuten auftauen lassen. Mehrmals vorsichtig auf die Röhrchen klopfen, um eine gleichmäßige Suspension zu erhalten.
3. Das SOC-Medium in Kulturröhrchen überführen, eins für jede Transformationsreaktion, und bei Raumtemperatur stehen lassen.
   
   (Das Volumen des SOC-Mediums hängt vom Volumen der Zellen ab, die im nächsten Schritt hinzugefügt werden. Das Endvolumen mit den kompetenten Zellen und dem SOC-Medium soll 1000 µl betragen.)
4. 1-mm-Standardküvetten und sterile Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis stellen, eine/eins für jede Transformationsreaktion.
5. Die kompetenten Zellen in gekühlte Mikrozentrifugenröhrchen überführen. 40 µl der Zellen aus der 80-µl-Packung und 50 µl der Zellen aus der 100-µl-Packung verwenden.
   1. Für die Kontrolle: 1 µl der 1 bis 5 verdünnten pUC19-Kontroll-DNA in ein Röhrchen geben.
   2. Eine 1- bis 5-fache Verdünnung der DNA oder des Ligationsgemischs in TE-Puffer vorbereiten. In Mikrozentrifugenröhrchen geben.
6. Das Gemisch aus DNA und Zellen in eine gekühlte 1-mm-Küvette pipettieren.
7. Den Elektroporator für 6 ms auf eine Feldstärke von 25 kV/cm einstellen und die Zellen behandeln.
8. Die Zellen aus den Küvetten nehmen und in Röhrchen mit SOC-Medium geben.
9. Die Zellen im Schüttelinkubator (225–250 rpm) bei 37 °C eine Stunde inkubieren
10. 10–100 µl jeder transformierten Zellsuspension auf LB-Agarplatten mit selektivem Antibiotikum pipettieren und mit einem sterilen Spreader verteilen.
11. Platten über Nacht bei 37 °C inkubieren.
12. Kolonie auswählen und bei Bedarf kultivieren.
13. Die Plasmid-DNA aus jeder Kultur isolieren.
14. Die Plasmid-DNA unter Einsatz von Restriktionsenzymen verdauen; Trennung durch Gelelektrophorese.
15. Die bevorzugten Klone kultivieren.

Wichtige Tipps zur Optimierung des Transformationsprozesses:

• Bestätigen, dass die Zellen noch gefroren sind und bei Erhalt noch Trockeneis vorhanden ist.
• Um eine maximale Transformationseffizienz zu erreichen, soll eine qualitativ hochwertige DNA-Probe verwendet werden, die frei von Phenol, Ethanol, Proteinen, Salzen oder Detergenzien ist. Bei der Verwendung elektrokompetenter Zellen führt ein hoher Salzgehalt in der DNA zu Lichtbögen bei hoher Spannung, durch welche die Probe und die Ausrüstung beschädigt werden können.
• DNA in Ligationsreaktionen, die qualitativ hochwertige Reagenzien enthalten, können für die Transformation verwendet werden. Die DNA-Ligase muss nicht inaktiviert werden.
• Die kompetenten Zellen immer auf Eis aufbewahren und eine versehentliche Erwärmung der Zellen vermeiden.
• Vorsichtig auf die Röhrchen klopfen, um eine gleichmäßige Suspension der Zellen zu erhalten. Nicht mit dem Vortexer oder der Pipette mischen.
• LB-Agarplatten auf 37 °C erwärmen, um ein optimales Koloniewachstum sicherzustellen.
• Elektroporatoreinstellungen für die Transformation unter Einsatz elektrokompetenter Zellen:
  • BTX-Modell ECM 630: HV-Modus, 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, 1-mm-Küvette
  • BioRad Gene Pulser: 2,5 kV, 25 µF, 100 Ω, 1-mm-Küvette

Literatur

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual.. New York: Cold spring harbor laboratory press.

2. Dubnau D. 1999. DNA Uptake in Bacteria. Annu. Rev. Microbiol.. 53(1):217-244. https://doi.org/10.1146/annurev.micro.53.1.217

3. Lorenz MG, Wackernagel W. 1994. Bacterial gene transfer by natural genetic transformation in the environment.. 58(3):563-602. https://doi.org/10.1128/mmbr.58.3.563-602.1994