Sanger-Sequenzierung – Schritte & Methode

Was ist die Sanger-Sequenzierung?

Die Sanger-Sequenzierung, auch als "Kettenabbruchmethode" bekannt, ist eine Methode zur Bestimmung der Nukleotidsequenz von DNA. Die Methode wurde vom zweifachen Nobelpreisträger Frederick Sanger und seinen Kollegen im Jahr 1977 entwickelt, daher der Name Sanger-Sequenzierung.

Eine Übersicht über die allgemeine Struktur der DNA finden Sie in Abbildung 2.

Wie funktioniert die Sanger-Sequenzierung?

Die Sanger-Sequenzierung kann manuell oder, was häufiger der Fall ist, automatisiert mit einem Sequenzierer durchgeführt werden (Abbildung 1). Jede Methode umfasst drei grundlegende Schritte, die nachstehend beschrieben werden.

Abbildung 1. Drei grundlegende Schritte der automatisierten Sanger-Sequenzierung.

Schritte der Sanger-Sequenzierung

Die Sanger-Sequenzierung besteht im Wesentlichen aus drei Schritten.

1. DNA-Sequenz für Kettenabbruch-PCR

Die DNA-Sequenz von Interesse wird als Template für einen PCR-Typ verwendet, die sogenannte PCR mit Kettenabbruch. Die PCR mit Kettenabbruch funktioniert grundsätzlich wie die Standard-PCR, weist jedoch einen wesentlichen Unterschied auf: Es werden modifizierte Nukleotide (dNTP), sogenannte Didesoxyribonukleotide (ddNTP), hinzugefügt. Im Verlängerungsschritt der Standard-PCR fügt die DNA-Polymerase dNTP zu einem wachsenden DNA-Strang hinzu, indem sie die Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen der freien 3'-OH-Gruppe des letzten Nukleotids und dem 5'-Phosphat des nächsten katalysiert (Abbildung 2).

Bei der PCR mit Kettenabbruch mischt der Anwender einen geringen Anteil Ketten-abbrechender ddNTP zu normalen dNTP in die PCR-Reaktion. ddNTP fehlt die 3'-OH-Gruppe, die für die Bildung von Phosphodiesterbindungen erforderlich ist. Wenn die DNA-Polymerase dann zufällig ein ddNTP einbaut, wird die Verlängerung unterbrochen. Das Ergebnis der PCR mit Kettenabbruch sind Millionen bis Milliarden von Oligonukleotid-Kopien der DNA-Sequenz von Interesse, die bei einer zufälligen Länge (n) durch 5'-ddNTP abgebrochen werden.

Bei der manuellen Sanger-Sequenzierung werden vier PCR-Reaktionen angesetzt, denen jeweils nur ein Typ ddNTP (ddATP, ddTTP, ddGTP und ddCTP) beigemischt wird.

Bei der automatisierten Sanger-Sequenzierung werden alle ddNTP in einer einzigen Reaktion gemischt, und jedes der vier dNTP hat eine eindeutige Fluoreszenzmarkierung.

2. Größentrennung durch Gelelektrophorese

Im zweiten Schritt werden die Oligonukleotide mit abgebrochenen Ketten mittels Gelelektrophorese nach Größe getrennt. Bei der Gelelektrophorese werden DNA-Proben in ein Ende einer Gelmatrix geladen und es wird ein elektrischer Strom angelegt. Da die DNA negativ geladen ist, werden die Oligonukleotide zur positiven Elektrode auf der gegenüberliegenden Seite des Gels gezogen. Da alle DNA-Fragmente die gleiche Ladung pro Masseneinheit haben, wird die Geschwindigkeit, mit der sich die Oligonukleotide bewegen, ausschließlich durch die Größe bestimmt. Je kleiner ein Fragment ist, desto weniger Reibung erfährt es auf seinem Weg durch das Gel, und desto schneller bewegt es sich. Das Ergebnis ist, dass die Oligonukleotide vom kleinsten zum größten Oligonukleotid angeordnet sind und das Gel von unten nach oben gelesen wird.

Bei der manuellen Sanger-Sequenzierung werden die Oligonukleotide aus jeder der vier PCR-Reaktionen auf vier separaten Gelbahnen aufgetragen. Auf diese Weise kann der Benutzer feststellen, welche Oligonukleotide den einzelnen ddNTP entsprechen.

Bei der automatisierten Sanger-Sequenzierung werden alle Oligonukleotide in einer einzigen Kapillargel-Elektrophorese im Sequenzierer durchgeführt.

3. Gelanalyse und Bestimmung der DNA-Sequenz

Im letzten Schritt wird einfach das Gel abgelesen, um die Sequenz der Eingabe-DNA zu bestimmen. Da die DNA-Polymerase DNA ausgehend von einem bereitgestellten Primer nur in der Richtung 5' nach 3' synthetisiert, entspricht jedes terminale ddNTP einem bestimmten Nukleotid in der ursprünglichen Sequenz (z. B. muss das kürzeste Fragment am ersten Nukleotid vom 5'-Ende enden, das zweitkürzeste Fragment muss am zweiten Nukleotid vom 5'-Ende enden usw.) Daher können wir durch Ablesen der Gelbanden von der kleinsten zur größten die 5'- bis 3'-Sequenz des ursprünglichen DNA-Strangs bestimmen.

Bei der manuellen Sanger-Sequenzierung liest der Benutzer alle vier Gelbahnen auf einmal von unten nach oben ab, wobei die Bahn verwendet wird, um die Identität des terminalen ddNTP für jede Bande zu bestimmen. Wird zum Beispiel die unterste Bande in der Spalte ermittelt, die ddGTP entspricht, dann endet das kleinste PCR-Fragment mit ddGTP und das erste Nukleotid vom 5'-Ende der ursprünglichen Sequenz hat eine Guaninbase (G).

Bei der automatisierten Sanger-Sequenzierung liest ein Computer jede Bande des Kapillargels der Reihe nach aus, wobei die Identität jedes terminalen ddNTP durch Fluoreszenz festgestellt wird. Kurz gesagt, ein Laser regt die Fluoreszenzmarkierungen in jeder Bande an, und ein Computer erkennt das daraus resultierende emittierte Licht. Da jedes der vier ddNTP mit einer anderen Fluoreszenzmarkierung versehen ist, kann das emittierte Licht direkt mit der Identität des terminalen ddNTP in Verbindung gebracht werden. Das Ergebnis ist ein sogenanntes Chromatogramm, in dem die Fluoreszenz-Peaks der einzelnen Nukleotide entlang der DNA-Template aufgezeigt werden.

Abbildung 2. Schematische Darstellung der DNA-Struktur. Die DNA ist ein Molekül, das aus zwei Strängen besteht, die sich umeinander winden und eine Doppelhelix bilden. Jeder Strang besteht aus einer Reihe von Molekülen, den Desoxyribonukleotiden (dNTP).

Jedes dNTP enthält eine Phosphatgruppe, eine Zuckergruppe und eine von vier Stickstoffbasen [Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) oder Cytosin (C)]. Die dNTP sind durch kovalente Phosphodiesterbindungen zwischen dem Zucker eines dNTP und der Phosphatgruppe des nächsten dNTP linear aneinandergereiht; dieses sich wiederholende Zucker-Phosphat-Muster bildet das Zucker-Phosphat-Rückgrat.

Die Stickstoffbasen der beiden getrennten Stränge sind durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Basen miteinander verbunden und bilden die DNA-Doppelhelix

Ablesen von Sanger-Sequenzierungsergebnissen

Das richtige Ablesen der Sanger-Sequenzierungsergebnisse hängt davon ab, welcher der beiden komplementären DNA-Stränge von Interesse ist und welcher Primer zur Verfügung steht. Wenn die beiden DNS-Stränge A und B sind und Strang A von Interesse, der Primer aber besser für Strang B geeignet ist, sind die ausgegebenen Fragmente identisch mit Strang A. Wenn dagegen Strang A von Interesse und der Primer besser für Strang A geeignet ist, ist die Ausgabe identisch mit Strang B. Entsprechend muss die Ausgabe wieder in Strang A umgewandelt werden.

Wenn also die Sequenz von Interesse "TACG" lautet und der Primer für diesen Strang am besten geeignet ist, lautet die Ausgabe "ATGC" und muss daher wieder in "TACG" umgewandelt werden. Wenn der Primer jedoch besser für den komplementären Strang ("ATGC") geeignet ist, dann lautet die Ausgabe "TACG", was die richtige Sequenz ist.

Kurz gesagt, bevor Sie beginnen, müssen Sie Ihr Ziel kennen und wie Sie es erreichen wollen! Um dies zu verdeutlichen, finden Sie hier ein Beispiel für die vorgenannten Erläuterungen (TACG -> ATGC -> TACG). Wenn die Didesoxynukleotide mit T = gelb, A = pink, C = dunkelblau und G = hellblau gekennzeichnet sind, sind die kurzen Sequenzen Primer-A, Primer-AT, Primer-ATG und Primer-ATGC das Resultat. Sobald die Fragmente durch Elektrophorese getrennt wurden, liest der Laser die Fragmente in der Reihenfolge ihrer Länge (pink, gelb, hellblau und dunkelblau) und erstellt ein Chromatogramm. Der Computer wandelt die Buchstaben um, sodass die finale Sequenz die richtige Reihenfolge TACG aufweist.

Sanger-Sequenzierung vs. PCR

In der Sanger-Sequenzierung und der PCR werden ähnliche Ausgangsstoffe eingesetzt und können in Verbindung miteinander verwendet werden, keine der beiden Methoden kann jedoch die andere ersetzen.

Die PCR dient der Amplifizierung der Gesamt-DNA. Während Fragmente unterschiedlicher Länge zufällig entstehen können (z. B. wenn die DNA-Polymerase abfällt), besteht das Ziel darin, die gesamte DNA-Sequenz zu duplizieren. Zu diesem Zweck sind die "Inhaltsstoffe" die Ziel-DNA, Nukleotide, DNA-Primer und DNA-Polymerase (insbesondere Taq-Polymerase, welche die für die PCR erforderlichen hohen Temperaturen überstehen kann).

Im Gegensatz dazu besteht das Ziel der Sanger-Sequenzierung darin, jede mögliche Länge der DNA bis zur vollen Länge der Ziel-DNA zu generieren. Deshalb sind neben den PCR-Ausgangsstoffen auch die Didesoxynukleotide erforderlich.

Sanger-Sequenzierung und PCR können bei der Erzeugung des Ausgangsstoffs für ein Sanger-Sequenzierungsprotokoll zusammengeführt werden. Mit der PCR können viele Kopien der zu sequenzierenden DNA erstellt werden.

Das Sanger-Protokoll wird effizienter, wenn mehr als ein Template zur Verfügung steht. Wenn die Zielsequenz 1000 Nukleotide lang ist und es nur eine Kopie der Template gibt, wird es länger dauern, die 1000 markierten Fragmente zu erzeugen. Wenn es jedoch mehrere Kopien des Templates gibt, wird es theoretisch weniger Zeit in Anspruch nehmen, alle 1000 markierten Fragmente zu erzeugen.