Cómo funcionan los análisis de ligadura de proximidad (PLA)

El análisis de ligadura de proximidad (PLA) DuoLink^® es una poderosa herramienta que permite la detección in situ de proteínas endógenas, modificaciones de proteínas e interacciones proteicas con alta especificidad y sensibilidad. Las dianas proteicas pueden detectarse y localizarse con facilidad con resolución monomolecular en células y tejidos no modificados. Por lo general, se utilizan dos anticuerpos primarios producidos en diferentes especies para detectar dos dianas proteicas únicas (Figura 1A). Un par de anticuerpos secundarios marcados con oligonucleótidos (sondas de PLA) se une a los anticuerpos primarios (Figura 1B). A continuación, los oligos conectores de hibridación se unen a las sondas de PLA solo si están muy cerca entre sí y la ligasa forma una plantilla de ADN circular cerrada que se requiere para la amplificación en círculo rodante (RCA) (Figura 1C). La sonda de PLA actúa entonces como cebador para una ADN polimerasa, que genera secuencias concateméricas durante la RCA (Figura 1D). Esto permite una señal amplificada hasta 1000 veces que sigue ligada a la sonda de PLA, lo que permite la localización de la señal. Por último, los oligos etiquetados hibridan con las secuencias complementarias dentro del amplicón (Figura 1E), que luego se visualizan y se cuantifican como puntos discretos (señales de PLA) mediante análisis de imagen microscópico (Figura 1F). El PLA DuoLink^® se puede realizar en células adherentes, preparaciones de citoespín y cortes de tejido en portaobjetos de vidrio utilizando inmunofluorescencia (es decir, detección de color verde, rojo, rojo lejano o naranja) o inmunohistoquímica (es decir, reacción catalizada por peroxidasas). Además, el PLA DuoLink^® puede realizarse en células sanguíneas o células en suspensión para su detección mediante citometría de flujo y se puede utilizar en placas de pozos múltiples (por ejemplo, 96 o 384 pozos) con un generador de imágenes de detección de alto contenido para análisis de gran rendimiento. La gran especificidad, sensibilidad y versatilidad del PLA DuoLink^® lo convierten en un método ideal para el análisis de vías, cinética de cribado de fármacos, determinación de IC₅₀ y validación de dianas.

Figura 1. Esquema de una reacción de PLA DuoLink^®. (A) Dos anticuerpos primarios reconocen proteínas específicas de interés en la célula. Los glóbulos amarillo y verde representan dos epítopos de una sola proteína o epítopos en dos proteínas diferentes que están interactuando. (B) Los anticuerpos secundarios acoplados a oligonucleótidos (sondas de PLA) se unen a los anticuerpos primarios. (C) Cuando las sondas de PLA están muy cerca, los oligos conectores se unen a las sondas de PLA y se ligan. (D) La plantilla de ADN cerrada circular resultante es amplificada por la ADN polimerasa. (E) Los oligos de detección complementaria acoplados a fluorocromos se hibridan a secuencias repetitivas en los amplicones. (F) Las señales de PLA se detectan mediante microscopia fluorescente como puntos discretos y proporcionan la localización intracelular de la proteína o la interacción proteica.

Detección de la dimerización de EGFR y HER2 mediante el análisis de ligadura de proximidad DuoLink^®

La dimerización del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1, HER1) y del receptor epidérmico humano 2 (HER2, ErbB2, Neu) es una interacción proteína-proteína (IPP) bien conocida. EGFR y HER2 son miembros de la familia ErbB de receptores tirosina cinasas que desempeñan papeles clave en la regulación de la división y la muerte celulares. Las mutaciones que afectan a la expresión o la actividad de cualquiera de estas proteínas están asociadas con el desarrollo de una variedad de cánceres. Tras la unión del ligando (por ejemplo, EGF) al dominio extracelular del EGFR, el receptor se activa y autofosforila su cola citoplásmica. Esto induce la formación de homodímeros (EGFR-EGFR) y heterodímeros (por ejemplo, EGFR-HER2) con otros miembros de la familia ErbB (Figura 2). La dimerización y la fosforilación subsiguiente provocan el reclutamiento de proteínas adaptadoras, la activación de cascadas de señalización intracelular y, en última instancia, cambios en la transcripción génica que pueden causar proliferación de células cancerosas, angiogénesis, invasión, metástasis y disminución de la apoptosis.

Figura 2. Esquema de dimerización EGFR-HER2. Ligandos como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se unen al dominio extracelular del EGFR, lo que produce la activación y la autofosforilación, y a su vez, produce la homodimerización del EGFR (no representado) o la heterodimerización con otros miembros de la familia ErbB, como el HER2. La dimerización y la fosforilación subsiguiente provocan la activación de las vías de señalización posteriores.

Origen de la imagen: Lancet Oncol. 16(15):e543-e554

Kit DuoLink^® de control del PLA: la IPP confirma que su experimento está funcionando

Las células de ovario humano cancerosas SK-OV3 expresan niveles de moderados a elevados de EGFR y HER2. Para confirmar la detección in situ de la dimerización EGFR-HER2 inducida por EGF, se utilizó el kit DuoLink^® de control del PLA, la IPP. Cada kit contiene dos portaobjetos con cámara de 8 pocillos con células SKOV3 prefijadas tratadas con anticuerpos primarios anti-EGFR de ratón y anti-HER2 de conejo. Ya se han determinado las concentraciones óptimas de anticuerpos primarios y se proporcionan recomendaciones en el prospecto del producto. Después de la rehidratación en PBS 1x, las células se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % en PBS 1x durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se bloquearon durante 1 hora a 37 °C utilizando tampón de bloqueo de PLA DuoLink^®. Las células en pocillos duplicados se incubaron luego con ambos anticuerpos primarios. Los controles técnicos negativos consistían en la incubación con cada anticuerpo primario por separado y sin anticuerpo primario, realizada también en pocillos duplicados (Figura 3). Después del lavado, se realizó el PLA DuoLink^® siguiendo el Protocolo del PLA DuoLink^® con fluorescencia. Todos los pocillos fueron incubados con sondas de PLA DuoLink^® anti-conejo PLUS y anti-ratón MINUS, y las señales de PLA se generaron utilizandoreactivo de detección DuoLink^® in situ rojo lejano. Los portaobjetos se montaron utilizando los medios de montaje in situDuoLink^® con DAPI y las imágenes se adquirieron utilizando el GE EN Cell Analyzer 2200.

Figura 3. Kit de control de PLA DuoLink^®, laIPP – Diseño del portaobjetos y ubicación de las muestras. Todos los pocillos contienen células SK-OV3 prefijadas estimuladas por EGF. Después de la permeabilización y el bloqueo, los pocillos 1 y 5 fueron incubados con anticuerpos primarios anti-EGFR de conejo y anti-HER2 de ratón, los pocillos 2 y 6 fueron incubados solo con anticuerpos anti-EGFR, los pocillos 3 y 7 fueron incubados solo con anticuerpos anti-HER2 y los pocillos 4 y 8 fueron incubados solo con diluyente de anticuerpos.

Se obtuvieron resultados de PLA similares cuando los anticuerpos primarios se incubaron durante 2 horas a 37 °C (Figura 4A-4D) o durante la noche a 4 °C (Figura 4E-4H), lo que permite una mayor flexibilidad al usuario. Se detectó una señal de PLA robusta en las células SK-OV3 activadas con EGF cuando estaban presentes los anticuerpos primarios anti-EGFR y anti-HER2, lo que indica abundantes complejos EGFR:HER2 (Figura 4A, 4E). A pesar del tratamiento uniforme de las células SK-OV3 con EGF, el número de señales de PLA/complejos EGFR:HER2 varió entre las células. Esto se debe probablemente a la expresión diferencial del HER2 dentro de la población de células SK-OV3 (datos no mostrados). Por el contrario, se detectaron muy pocas señales de PLA cuando se utilizó solo un anticuerpo primario o cuando se omitieron ambos anticuerpos primarios (Figura 4B-D, 4F-H). Cabe destacar que una concentración demasiado alta de los anticuerpos primarios puede inducir un mayor número de señales de PLA cuando se usan por separado o puede inducir la coalescencia de señales de PLA positivas que no se pueden cuantificar con precisión (datos no mostrados). Por consiguiente, es importante utilizar las concentraciones recomendadas de anticuerpos primarios. En conjunto, estos datos demuestran que los complejos EGFR:HER2 se pueden detectar y cuantificar en células SK-OV3 estimuladas con EGF utilizando el kit de control de PLA DuoLink^®, PPI.

Figura 4. Detección de la dimerización EGFR:HER2 inducida por EGF usando el PLA DuoLink^®. Portaobjetos de células SK-OV3 fijadas y tratadas con EGF se incubaron con anticuerpos anti-EGFR de ratón y anti-HER2 de conejo (A, E), anticuerpos anti-EGFR solo (B, F), anticuerpos anti-HER2 solo (C, G) o diluyente de anticuerpos solo (D, H) durante 2 horas a 37 °C (A-D) o durante la noche a 4 °C (E-H). A continuación se realizó el PLA DuoLink^® utilizando sondas de PLA PLUS anti-conejo y MINUS anti-ratón. Se adquirieron diez imágenes aleatorias 20x por pocillo utilizando los filtros DAPI (núcleos azules) y Cy5 (señales de PLA rojas). Las imágenes son representativas de al menos 5 experimentos independientes.

Formatos de detección de proteínas para productos de PLA DuoLink^®

Los productos de PLA DuoLink^® están disponibles para fluorescencia y campo claro. En la actualidad, los reactivos de PLA DuoLink^® con fluorescencia se pueden utilizar en formatos de aplicación de microscopia y de citometría de flujo.

Detección fluorescente

La microscopia fluorescente es el formato de aplicación más utilizado para los experimentos de PLA DuoLink^®. Gran parte del protocolo es el mismo cuando se utilizan los reactivos DuoLink^® PLA de fluorescencia que con la inmunofluorescencia (IF) tradicional, sin embargo, la tecnología DuoLink^® PLA exhibe mayor especificidad y versatilidad que la IF. El paso de amplificación añadido incluido en el procedimiento de PLA DuoLink^® proporciona una mayor sensibilidad.

Detección en campo claro

Al igual que con la inmunohistoquímica (IHC) tradicional, el PLA de campo claro DuoLink^® se utiliza predominantemente en cortes de tejidos fijados en formol e incluidos en parafina, pero es compatible con otros tipos de muestras. Los reactivos de detección de PLA DuoLink^® de campo claro contienen oligonucleótidos etiquetados con peroxidasa de rábano picante (HRP) que, en presencia de un sustrato de la HRP, forman un precipitado enzima:sustrato visible con el microscopio óptico.

Citometría de flujo

El kit de PLA DuoLink^®Flow es una herramienta de análisis estadístico rápida y potente. Este kit identifica las interacciones proteína-proteína o la ubicación subcelular. La combinación de DuoLink^® PLA con la citometría de flujo permite la recopilación de datos cuantitativos con un elevadorendimiento.

Cómo empezar con la tecnología de PLA DuoLink^®

El kit iniciador del PLA DuoLink^® contiene todos los reactivos necesarios para realizar un experimento de PLA Duolink^® y analizar hasta 30 muestras. Todo lo que usted tiene que proporcionar son muestras celulares o de tejido preparadas, anticuerpos primarios y equipo de laboratorio común.

Un kit iniciador de PLA DuoLink^® contiene:

• Dos sondas de PLA: una PLUS y una MINUS (que coincidan con el hospedador de los anticuerpos primarios)
• Diluyente de anticuerpos y tampón bloqueante
• Reactivo de detección: elección derojo o naranja
• Tampón de amplificación y enzima polimerasa
• Disolución de reserva de ligadura y enzima ligasa
• Tampones de lavado A y B.
• Medio de montaje con DAPI

Además de los protocolos de PLA DuoLink^® para fluorescencia, campo claro y citometría de flujo, asegúrese de visitar nuestro Centro de Recursos donde encontrará detalles sobre cómo configurar y ejecutar con éxito un experimento de PLA DuoLink^®:

• Cómo optimizar el análisis DuoLink®
• Guía de selección de productos para PLA DuoLink^®
• Resolución de problemas y preguntas frecuentes
• Video instructivo sobre el PLA DuoLink^®