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Protocolo de PLA DuoLink® con fluorescencia

En este protocolo se describe el uso de los reactivos DuoLink® para ensayos de ligadura de proximidad (PLA) destinados a la detección, la visualización y la cuantificación de proteínas individuales, modificaciones de proteínas e interacciones proteicas en muestras de tejido y células. Para familiarizarse con la tecnología PLA DuoLink®, descargue nuestro folleto y revise Cómo optimizar el ensayo de ligadura de proximidad DuoLink® para obtener más detalles. Para otros protocolos, consulte el Protocolo de campo brillante para PLA DuoLink® y la Guía del usuario de Probemaker para PLA DuoLink®. 

Materiales y equipo
Protocolo de PLA DuoLink® con fluorescencia
Resultados
Resolución de problemas
Referencias

Materiales y equipo

Productos para PLA DuoLink®

Consulte la Guía de selección de productos para PLA DuoLink® donde encontrará recomendaciones específicas de productos. En resumen, para ejecutar un experimento de PLA DuoLink® con detección fluorescente, se necesitan los siguientes productos PLA DuoLink®:

  1. Sondas para PLA DuoLink® (una PLUS y una MINUS de diferentes especies, que coincidan con la especie hospedadora de sus anticuerpos primarios). Cada kit contiene:
    1. Sondas de PLA (5x) – PLUS o MINUS, dependiendo del producto
    2. Disolución de bloqueo, para bloquear la muestra antes de la incubación con los anticuerpos
    3. Diluyente del anticuerpo, para dilución de las sondas de PLA y, si es necesario, los anticuerpos primarios
    NOTA: conserve todos los componentes del kit a 4 °C.

    Nota: pueden utilizarse los kits DuoLink® PLA Probemaker PLUS o Probemaker MINUS para generar sondas de PLA personalizadas si es necesario. Consulte los detalles en la Guía Probemaker.

  2. Reactivo de detección fluorescente DuoLink® (elija entre verde, naranja, rojoy rojo lejano). Cada kit contiene:
    1. Stock de ligadura (x5) – Diluida para hacer tampón de ligadura x1
    2. Ligasa (1 U/μl) – Añadida para hacer la Disolución de ligadura
    3. Stock de amplificación (5x) – Diluida para hacer tampón de amplificación x1
    4. Polimerasa (10 U/μl) - Añadida para hacer la disolución de amplificación
    NOTA: conserve todos los componentes a -20 °C.
  3. Tampones de lavado de fluorescencia (A y B)
  4. Medios de montaje DuoLink® con DAPI (para utilizar en portaobjetos, conservar a 2-8 °C) O Colorante nuclear y anti-desteñimiento (para utilizar en microplacas, conservar a -20 °C)

Otros materiales

  1. Anticuerpos primarios de elección para detectar las proteínas de interés. Deben haberse producido en ratón, conejo o cabra al utilizarlas junto con las sondas para PLA DuoLink®.
  2. Agua ultrapura (esterilizada por filtración, Milli-Q® o similar)
  3. Muestra (células o tejido) en un portaobjetos, pretratada con respecto a la fijación, la recuperación y la permeabilización. En Cómo optimizar el análisis de ligadura de proximidad DuoLink® encontrará sugerencias y recomendaciones, y detalles sobre los siguientes temas:
    1. Diseño experimental y controles
    2. Elección de anticuerpos primarios y optimización
    3. Procesamiento de la muestra

Equipo

  1. Microscopio de fluorescencia con filtros apropiados, cámara y software para la adquisición de imágenes
  2. Incubador a 37 °C
  3. Agitador orbital
  4. Cámara climática o Bloque de transferencia térmica en microplaca
  5. Pluma hidrófoba para delimitar el área de reacción
  6. Bloque congelador (para enzimas)
  7. Tarros de tinción
  8. Pinzas
  9. Pipetas y puntas (de 1 μl a 1000 μl)
  10. Cubreobjetos compatibles con microscopia de fluorescencia

Protocolo para PLA DuoLink® con fluorescencia

El siguiente protocolo es para una muestra de 1 cm2 en un portaobjetos, que requiere 40 µl de disolución para una cobertura adecuada. Ajuste el volumen en función de su área de reacción y el número de muestras. Todas las incubaciones deben realizarse en una cámara de humedad. Todos los pasos de lavado deben realizarse a temperatura ambiente en un tarro de tinción con al menos 70 ml de amortiguador con agitación suave.

Preparación del reactivo

  1. Los tampones de lavado A y B deben prepararse antes de comenzar el ensayo disolviendo el contenido de una bolsa en agua de gran pureza hasta un volumen final de 1000 ml. Las disoluciones pueden conservarse a temperatura ambiente para almacenamiento a corto plazo (menos de dos semanas) o a 4°C para almacenamiento prolongado. NOTA: lleve las disoluciones a temperatura ambiente antes de su uso.
  2. El tampón de lavado B 0,01x debe prepararse antes de comenzar el ensayo diluyendo tampón de lavado B 1x 1:100 en agua de gran pureza.
  3. Muchos reactivos DuoLink® PLA se suministran como disolución madre concentrada y deben diluirse inmediatamente antes de su uso. No almacene los reactivos para PLA DuoLink®.

Protocolo para PLA DuoLink®

Antes de empezar, las muestras deben depositarse en portaobjetos de vidrio y pretratarse con respecto a la fijación, la recuperación o la permeabilización. Revise Cómo optimizar el análisis de ligadura de proximidad DuoLink® para obtener más detalles.

  1. Bloqueo
    1. Agite en Vórtex la disolución de bloqueo DuoLink®.
    2. Agregue 1 gota (~40 µl) de disolución de bloqueo DuoLink® a cada 1cm2 de muestra. Cerciórese de cubrir toda la muestra con la disolución de bloqueo.
    3. Incube los portaobjetos en una cámara de humedad calentada durante 60 minutos a 37 °C..
  2. Incubación de los anticuerpos primarios NOTA: no deje secar el portaobjetos antes de agregar los anticuerpos, ya que esto puede causar fondo.
    1. Agite en Vórtex el diluyente de anticuerpos DuoLink®.
    2. Diluya su anticuerpo o anticuerpos primarios a una concentración adecuada en el diluyente de anticuerpos DuoLink®.
    3. Retire la disolución de bloqueo DuoLink® de los portaobjetos
    4. Agregue la disolución de anticuerpos primarios a cada muestra.
    5. Incube los portaobjetos en una cámara de humedad. Utilice la temperatura y el tiempo de incubación óptimos para sus anticuerpos primarios.
  3. Incubación de la sonda para PLA DuoLink®
    1. Agite en Vórtex las sondas para PLA PLUS y MINUS
    2. Diluya las sondas para PLA PLUS y MINUS 1:5 en el diluyente de anticuerpos DuoLink®.
      Para una reacción de 40 µl, tome 8 µl de reserva de sonda MINUS para PLA, 8 µl de reserva de sonda PLUS para PLA y 24 µl de diluyente de anticuerpos. Prepare disolución suficiente para todas las muestras.
    3. Retire la disolución de anticuerpos primarios de los portaobjetos
    4. Lave los portaobjetos 2x 5 minutos en 1x de tampón de lavado A a temperatura ambiente.
    5. Retire el exceso de tampón de lavado y aplique la disolución de sonda PLA.
    6. Incube los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante 1 hora a 37 °C.
  4. Ligadura
    NOTA: espere a agregar la ligasa hasta inmediatamente antes de añadirla a la muestra. Asegúrese de que el tampón de ligadura esté completamente descongelado y mezclado bien antes de usarlo.
    1. Diluya el tampón de ligadura DuoLink® 5x 1:5 en agua de gran pureza y mezcle.
      Para una reacción de 40 µl, agregue 8 µl del tampón de ligadura 5x a 32 µl de agua de gran pureza. Prepare disolución suficiente para todas las muestras.
    2. Retire la disolución de sonda PLA de los portaobjetos.
    3. Lave los portaobjetos 2x 5 minutos en 1x de tampón de lavado A a temperatura ambiente.
    4.  Durante el lavado, recupere la ligasa del congelador usando un bloque congelador (-20 °C).
    5. Agregue la ligasa al tampón de ligadura 1x del paso (a) a una dilución 1:40 y mezcle.
      Para una disolución de ligadura de 40 µl, añada 1 µl de ligasa a 39 µl del tampón de ligadura 1x.
    6. Retire el exceso de tampón de lavado y aplique la disolución de ligadura.
    7. Incube los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante 30 minutos a 37 °C.
  5. Amplificación
    NOTA: espere a agregar la polimerasa hasta inmediatamente antes de añadirla a la muestra. El tampón de amplificación es sensible a la luz. Proteja de la luz todas las disoluciones que contengan el tampón.
    1. Diluya el tampón de amplificación 5x 1:5 en agua de gran pureza y mezcle. Para una reacción de 40 µl, agregue 8 µl del tampón de amplificación 5x a 32 µl de agua de gran pureza. Prepare disolución suficiente para todas las muestras.
    2. Retire la disolución de ligadura de los portaobjetos.
    3. Lave los portaobjetos 2x 5 minutos en tampón de lavado A 1x a temperatura ambiente.
    4. Durante el lavado, recupere la polimerasa del congelador usando un bloque congelador (-20 °C).
    5. Agregue la polimerasa al tampón de amplificación 1x del paso (a) a una dilución 1:80 y mezcle.
    6. Retire el exceso de tampón de lavado y aplique la disolución de amplificación.
    7. Incube los portaobjetos en una cámara de humedad precalentada durante 100 minutos a 37 °C.
  6. Lavados finales
    NOTA: reactivos sensibles a la luz. Mantenga los portaobjetos protegidos de la luz en todo momento.
    1. Retire la disolución de amplificación de los portaobjetos.
    2. Lave los portaobjetos 2x 10 minutos en tampón de lavado B 1x a temperatura ambiente.
    3. Lave los portaobjetos en tampón de lavado B 0.01x durante 1 minuto.
  7. Preparación para la obtención de imágenes
    NOTA: los medios de montaje in situ DuoLink®con DAPI son acuosos y no solidifican. Puede utilizarse esmalte de uñas transparente para sellar los bordes del cubreobjetos con el portaobjetos. Evite que queden burbujas de aire atrapadas debajo del cubreobjetos.
    1. Retire el exceso de tampón de lavado de los portaobjetos.
    2. Monte los portaobjetos con un cubreobjetos utilizando un volumen mínimo de medio de montaje in situ DuoLink® con DAPI.
    3. Espere 15 minutos antes de analizar en un microscopio de fluorescencia o confocal, usando al menos un objetivo de 20 aumentos.
    4. Después de obtener las imágenes, guarde los portaobjetos en la oscuridad a 4 °C durante un máximo de 4 días o a -20 °C durante un máximo de 6 meses

Resultados

Adquisición de imágenes

El resultado de un experimento de PLA DuoLink® se ve normalmente con un microscopio de fluorescencia y los filtros apropiados para la detección del fluoróforo utilizado. La señal de PLA DuoLink® se reconoce como puntos fluorescentes discretos en varias ubicaciones de las células estudiadas (Figura 1A). Las señales individuales son de tamaño submicrométrico y pueden estar en varios planos focales. Por lo tanto, puede ser necesario obtener imágenes por todo el espesor de la muestra. Sin embargo, las imágenes pueden adquirirse en un solo plano, siempre y cuando todas las imágenes que se vayan a comparar se adquieran en una posición similar dentro de la muestra. Cabe destacar que a menudo se detectan unas pocas señales en los controles técnicos negativos (por ejemplo, sin anticuerpos primarios, Figura 1B). Sin embargo, si se obtienen más de una o dos señales por cada diez células, puede que sea necesaria una valoración más del anticuerpo primario

Detección de EGFR en preparaciones de citoespín de células A431 utilizando DuoLink® PLA.

Figura 1.Detección de EGFR en preparaciones de citoespín de células A431 utilizando DuoLink® PLA. Las imágenes muestran una proyección de intensidad máxima de la imagen sin procesar basada en 20 planos z. Las señales de PLA se muestran en rojo y los núcleos en azul. La imagen del núcleo se adquirió en un plano z. A) Reacción positiva. B) Control negativo sin anticuerpos primarios.

Es importante que se utilicen los mismos ajustes (tiempo de exposición, ganancia, filtros utilizados, etc.) para capturar todas las imágenes en un experimento. Los ajustes se pueden optimizar utilizando controles positivos y negativos. Si el número de señales de PLA es grande, las señales de PLA pueden fusionarse/juntarse (Figura 2). Esto puede ocurrir cuando se estudian proteínas muy expresadas o durante la captura de imágenes debido a sobreexposición. En ese caso, hay que tener cuidado de establecer los ajustes de adquisición para obtener señales de PLA individuales. En la Guía de resolución de problemas de PLA DuoLink® encontrará consejos sobre cómo evitar la coalescencia de la señal y otras posibles áreas de optimización.

Detección de Her2 en preparaciones FFPE de células SKBR-3 de alta expresión utilizando DuoLink® PLA.

Figura 2.Detección de Her2 en preparaciones FFPE de células SKBR-3 de alta expresión utilizando DuoLink® PLA. Las imágenes muestran una proyección de intensidad máxima de la imagen sin procesar basada en 20 planos z. Las señales de PLA se muestran en rojo y los núcleos en azul. La imagen del núcleo se adquirió en un plano z. A) Reacción positiva. B) Control negativo sin anticuerpos primarios.

Análisis de la imagen

Existen varias herramientas de análisis de imágenes que se pueden utilizar para cuantificar las señales de PLA. Los datos de la imagen se pueden analizar para la intensidad de fluorescencia media de las señales de PLA o el número total de señales de PLA por célula o por área dentro de la célula (Figura 3). La cuantificación se notifica entonces como relativa a los controles técnicos o biológicos dentro de un experimento determinado. Sin embargo, una cuantificación fiable solo es posible si las señales de PLA no se han fusionado y los píxeles de la imagen no se han saturado.

Análisis de la imagen utilizando software de imagen

Figura 3.Análisis de imágenes utilizando software de imagen. Los núcleos teñidos con DAPI (azul) se detectaron automáticamente y el tamaño del citoplasma fue estimado por el usuario (contornos verdes). Las señales de PLA se muestran en rojo representando la proteína diana de interés. Las señales de PLA marcadas con círculos blancos y los núcleos delineados en amarillo se cuantificaron durante el análisis.

Resolución de problemas

En la Guía de resolución de problemas de PLA DuoLink® encontrará consejos y trucos, pautas generales de resolución de problemas y un conjunto de preguntas frecuentes (FAQ).

No dude en ponerse en contacto con nuestro equipo de asistencia técnica o con su representante de ventas local para obtener ayuda con sus experimentos.

Servicios de personalización

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Materiales
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Referencias bibliográficas

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Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200
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Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947
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Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101
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Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473
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