S7150
Kit de détection de l′oxydation des protéines OxyBlot
The OxyBlot Protein Oxidation Detection Kit provides the reagents to perform the immunoblot detection of carbonyl groups introduced into proteins by oxidative reactions with ozone or oxides of nitrogen or by metal catalyzed oxidation.
Synonyme(s) :
OxyBlot assay, Protein oxidation kit
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About This Item
Code UNSPSC :
12161503
eCl@ss :
32161000
Nomenclature NACRES :
NA.84
Produits recommandés
Niveau de qualité
Fabricant/nom de marque
Chemicon®
OxyBlot
Technique(s)
western blot: suitable
Méthode de détection
chemiluminescent
Conditions d'expédition
wet ice
Description générale
Une modification oxydante des protéines par les radicaux libres d'oxygène et d′autres espèces réactives se produit lors des processus physiologiques et pathologiques. Du fait de cette modification, des groupements carbonyle sont introduits dans les chaînes latérales protéiques selon un mécanisme spécifique à chaque site. Le Kit OxyBlot contient des réactifs pour l′immunodétection simple et sensible de ces groupements carbonyle, qui constituent une caractéristique principale de l′état d′oxydation des protéines.
Application
Préparation d′un lysat cellulaire
1. Dans le récipient ou le flacon, laver à deux reprises les cellules adhérentes avec du PBS glacé, puis égoutter le PBS. Laver les cellules non adhérentes dans du PBS et les centrifuger pendant 5 minutes entre 800 et 1000 tr/min dans une centrifugeuse de paillasse afin d′obtenir un culot de cellules.
2. Ajouter du tampon RIPA glacé aux cellules (1 ml par 107 cellules/boîte de 100 mm/fiole de 150 cm2 ; 0,5 ml par 5 x 106 cellules/boîte de 60 mm/fiole de 75 cm2).
3. Racler les cellules adhérentes présentes dans la boîte ou la fiole à l′aide d′un bout en caoutchouc ou d′un grattoir de cellules en plastique préalablement refroidi dans de l′eau distillée glacée. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger. Agiter doucement la suspension sur un agitateur basculant ou un agitateur orbital dans la chambre froide pendant 15 minutes afin de lyser les cellules.
4. Centrifuger le lysat à 14 000 x g dans une centrifugeuse préalablement refroidie pendant 15 minutes. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter le culot.
5. Avant de déterminer la concentration en protéines, diluer au moins au 1/10ème le lysat cellulaire, du fait de l′interférence des détergents contenus dans le tampon de lyse avec le réactif du type Coomassie. À cette étape, l′échantillon peut être divisé en aliquotes et conservé à -20 °C jusqu′à un mois.
CONSEIL : Lorsque la méthode de travail implique de grands volumes de cellules non adhérentes, les cellules risquent de ne pas être refroidies suffisamment vite pour maintenir l′activité de la protéine étudiée. Dans ce cas, verser la suspension de cellules dans un mélange de masses égales de 2 x PBS et de glace, puis récupérer les cellules par centrifugation et les lyser comme indiqué ci-dessus.
Tampon de lyse RIPA :
Référence 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
Il est très important d′utiliser un agent réducteur pour empêcher l′oxydation :
Le lysat de protéines peut être préparé selon divers protocoles. La plupart des tampons standard, du type RIPA ou Triton par exemple, conviennent également. Il est recommandé d′ajouter un agent réducteur au tampon de lyse afin d′empêcher l′oxydation des protéines qui est susceptible de se produire après la lyse des cellules. Un tampon de lyse contenant soit 1-2 % de 2-mercaptoéthanol soit du DTT 50 mM permet d′inhiber suffisamment cette oxydation, mais n′a aucun effet indésirable sur la réaction de dérivatisation dans le protocole OxyBlot. Les échantillons de protéines purifiés peuvent aussi être analysés avec le kit OxyBlot.
Pour obtenir des informations d′ordre général sur l′extraction de protéines, cliquez sur ce lien :
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
1. Dans le récipient ou le flacon, laver à deux reprises les cellules adhérentes avec du PBS glacé, puis égoutter le PBS. Laver les cellules non adhérentes dans du PBS et les centrifuger pendant 5 minutes entre 800 et 1000 tr/min dans une centrifugeuse de paillasse afin d′obtenir un culot de cellules.
2. Ajouter du tampon RIPA glacé aux cellules (1 ml par 107 cellules/boîte de 100 mm/fiole de 150 cm2 ; 0,5 ml par 5 x 106 cellules/boîte de 60 mm/fiole de 75 cm2).
3. Racler les cellules adhérentes présentes dans la boîte ou la fiole à l′aide d′un bout en caoutchouc ou d′un grattoir de cellules en plastique préalablement refroidi dans de l′eau distillée glacée. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger. Agiter doucement la suspension sur un agitateur basculant ou un agitateur orbital dans la chambre froide pendant 15 minutes afin de lyser les cellules.
4. Centrifuger le lysat à 14 000 x g dans une centrifugeuse préalablement refroidie pendant 15 minutes. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter le culot.
5. Avant de déterminer la concentration en protéines, diluer au moins au 1/10ème le lysat cellulaire, du fait de l′interférence des détergents contenus dans le tampon de lyse avec le réactif du type Coomassie. À cette étape, l′échantillon peut être divisé en aliquotes et conservé à -20 °C jusqu′à un mois.
CONSEIL : Lorsque la méthode de travail implique de grands volumes de cellules non adhérentes, les cellules risquent de ne pas être refroidies suffisamment vite pour maintenir l′activité de la protéine étudiée. Dans ce cas, verser la suspension de cellules dans un mélange de masses égales de 2 x PBS et de glace, puis récupérer les cellules par centrifugation et les lyser comme indiqué ci-dessus.
Tampon de lyse RIPA :
Référence 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188
Il est très important d′utiliser un agent réducteur pour empêcher l′oxydation :
Le lysat de protéines peut être préparé selon divers protocoles. La plupart des tampons standard, du type RIPA ou Triton par exemple, conviennent également. Il est recommandé d′ajouter un agent réducteur au tampon de lyse afin d′empêcher l′oxydation des protéines qui est susceptible de se produire après la lyse des cellules. Un tampon de lyse contenant soit 1-2 % de 2-mercaptoéthanol soit du DTT 50 mM permet d′inhiber suffisamment cette oxydation, mais n′a aucun effet indésirable sur la réaction de dérivatisation dans le protocole OxyBlot. Les échantillons de protéines purifiés peuvent aussi être analysés avec le kit OxyBlot.
Pour obtenir des informations d′ordre général sur l′extraction de protéines, cliquez sur ce lien :
http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction
Stockage et stabilité
Dès réception, conserver la protéine étalon (composant 90450) entre -25 °C et -15 °C. Conserver tous les autres composants entre 2 °C et 8 °C.
Informations légales
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Clause de non-responsabilité
Sauf indication contraire dans notre catalogue ou tout autre document associé au(x) produit(s) concerné(s), nos produits sont uniquement destinés aux activités de recherche et ne sauraient être utilisés à d'autres fins, ce qui inclut, sans toutefois s'y limiter, les utilisations commerciales non autorisées, les utilisations diagnostiques in vitro, les utilisations thérapeutiques ex vivo ou in vivo ou tout type de consommation ou d'application chez l'homme ou l'animal.
Mention d'avertissement
Warning
Mentions de danger
Conseils de prudence
Classification des risques
Met. Corr. 1 - Skin Sens. 1
Code de la classe de stockage
8A - Combustible corrosive hazardous materials
Certificats d'analyse (COA)
Recherchez un Certificats d'analyse (COA) en saisissant le numéro de lot du produit. Les numéros de lot figurent sur l'étiquette du produit après les mots "Lot" ou "Batch".
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