Concentración rápida de anticuerpos con los filtros para centrífuga Amicon^® Ultra

Introducción

Los protocolos de purificación de las inmunoglobulinas suelen incluir la unión por afinidad a los medios cromatográficos de proteína A o G, el lavado de las proteínas no adheridas y la elusión con un tampón de pH bajo. Los anticuerpos purificados resultantes suelen estar demasiado diluidos para las etapas posteriores de los estudios o para conservación a largo plazo. A menudo hay que realizar diálisis para concentrar el anticuerpo o cambiar el amortiguador por uno que preserve la actividad de la proteína. La ultrafiltración logra el mismo resultado más deprisa, con una recuperación de inmunoglobulinas de hasta el 99 % y eliminación de sal en un solo paso (ver el protocolo de concentración, desalación y cambio de tampón).

Método y resultados

Purificación y concentración de IgG de conejo con kits de purificación de anticuerpos Prosep^® A y Prosep^® G Montage^® y filtros para centrífuga Amicon^® Ultra-15 ml.

A. Purificación de IgG utilizando los kits Montage^®

1. Equilibrar las resinas Prosep^® A o Prosep^® G con 10 ml de tampón de unión y centrifugar durante 5 min a 500 xg
2. Preclarificar la muestra de suero haciéndola pasar por un filtro Steriflip^® GP de 0,22 µm.
3. Diluir la muestra 1:1 con el tampón de unión A y centrifugar la unidad a 100-150 x g durante 20 min.
4. Lavar la columna de centrifugación con 20 ml de tampón de unión A para eliminar los contaminantes no unidos centrifugando la columna durante 5 minutos a 500 x g.
5. Eluir las muestras añadiendo 10 ml de tampón de elución B2 en un tubo de centrifugación nuevo que contenga 1,3 ml de tampón de neutralización.
6. Medir la concentración total de proteínas de la muestra utilizando un método de concentración adecuado, como la absorbancia UV a 280 nm.

B. Concentración de IgG utilizando unidades Amicon^® Ultra-15 MWCO 30kDa

1. Agregar la fracción eluida neutralizada en la unidad Amicon^® Ultra 15 ml MWCO 30 kDa.
2. Centrifugar durante 10 a 20 minutos a 4000 x g en un rotor oscilante o a 5000 x g en un rotor de ángulo fijo hasta que la muestra haya alcanzado la concentración deseada.