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- Microbial Growth Requirements
- 物理/環境因素
- 微生物的分類與鑑定
- Monitoring Microbial Growth
- Preserving Bacterial Cultures
- References &文獻
所有微生物學家的最初目標都是讓他們的微生物培養物能可重複生長，不論這些微生物是來自自然界還是經過人工基因改造。可重複生長需要與能量來源、溫度、pH 值和養分有關的特定環境條件 (Microbial Growth Requirements)。有鑑於此，我們提供一系列的產品和服務 (請參閱培養物集清單、培養基比較等)，以滿足一般微生物學家和專家的需求。
微生物
在被歸類為微生物的生物群中，有簡單的單細胞形式（球菌、桿菌、病毒和螺旋體），也有多細胞形式（細絲和鞘）。這群微生物包括藍綠藻（藍細菌）、真菌、原生動物和細菌。
為了生存和成長，微生物需要能量和養料來源。細菌是微生物最原始的形式，但卻由大量簡單和複雜的分子組成，並能進行各種化學轉換。根據它們的需求和使用的能量來源，它們被分為不同的營養群。
圖 1.
微生物的大小不一，從只能在電子顯微鏡下看到的幾分之一微米的病毒，到幾厘米長的絲狀藻類或真菌，例如：
* 也可作為緩衝劑。
1為了促進鐵在溶液中的溶解或保留，可在培養基中加入络合剂，如 EDTA 或 citrate。
物理/環境因素
溫度
大多數微生物在人、高等植物和動物喜愛的正常溫度下生長良好。然而，某些細菌的生長溫度（極熱或極冷）很少有高等生物可以存活。根據其喜好的溫度範圍，細菌可分為三類：Psychrophiles (嗜冷性微生物) 主要存在於海洋深處、冰雪中及北極地區，其最適生長溫度介於 0 °C 與 15 °C 之間，最高生長溫度不超過 20 °C。在水、土壤和高等生物中發現的嗜中溫菌 (Mesophiles) 是研究中最常見的微生物類型。它們的最適生長溫度介於 25 °C 與 40 °C 之間。許多致病細菌的最適生長溫度為 37 °C，因此嗜中溫微生物構成了我們常見的腐敗和疾病微生物。嗜熱菌（喜熱微生物）能在高溫下生長，最適生長溫度在 60 °C 以上。有些微生物的生長溫度接近水的沸點，在壓力下甚至高於 100 °C。大多數的嗜熱菌無法在低於 45 °C 的溫度下生長。
pH
大多數的細菌最適合在 pH 值介於 6.5 和 7.5 之間、pH 值接近中性的狹窄環境中生長。那些在極端 pH 值下生長的細菌被歸類為嗜酸菌（喜酸）或嗜鹼菌（喜鹼）。嗜酸菌在 pH 值低於 4 的環境中生長，有些細菌在 pH 值為 1 時仍然活躍；嗜鹼菌喜歡 pH 值為 9-10 的環境，大多數細菌無法在 pH 值為中性或低於中性的溶液中生長。在細菌生長過程中，有機酸性物質通常會釋放至培養基，降低其 pH 值，因此會干擾或完全抑制進一步生長。雖然常見的培養基成分（如蛋白胨和胺基酸）有少許緩衝作用，但大多數細菌培養基仍需要外加緩衝劑來中和酸性物質並維持正確的 pH 值。磷酸鹽是最常用的緩衝劑，因為它們的緩衝作用在大多數細菌的生長範圍內，而且無毒，並能提供磷這種必要的營養元素。不過，高濃度磷酸鹽也有缺點，那就是會造成嚴重的養分限制，原因是不溶性的金屬磷酸鹽（例如鐵）會在培養基中析出。
滲透壓
微生物大約含有 80-90% 的水分，如果將其放置在溶質濃度較高的溶液中，就會流失水分，造成細胞縮小（漿溶）。然而，有些細菌非常適應高濃度的鹽分，它們實際上需要高濃度的鹽分才能生長。這些細菌被稱為嗜鹽菌（halophiles），可在鹽田或死海等地區找到。
圖 2：
氧氣
利用氧氣產生能量的微生物稱為好氧菌，如果它們的新陳代謝需要氧氣，則稱為厭氧菌。厭氧菌處於劣勢，因為氧在水中的溶解度很低，而且大部分環境都缺乏這種必要的元素。通常，需氧細菌保留了無氧生長的能力；這些細菌稱為兼性厌氧細菌。那些無法使用氧氣，而且事實上可能會受到氧氣傷害的細菌則稱為強制性厭氧菌。更多的群體包括：嗜微氣菌（microaerophiles），它們是好氧微生物，只能耐受通常低於大氣中氧濃度的狹窄範圍，因此通常難以在實驗室中培養；耐氣菌（aerotolerant bacteria），它們在有氧的環境中生長，但不需要氧。
水
與高等生物不同，微生物的新陳代謝依賴於水的存在。微生物對於可用水份的需求有很大的差異。
二氧化碳
在自養新陳代謝中，微生物捕捉各種能量來源和還原力，並利用這些能量和還原力將 CO2 還原為有機化合物。如果要培養自養型 CO2 固定微生物，通常會在培養基中加入碳酸氫鈉，並在密閉容器中的含二氧化碳大氣中進行培養，或者在容器中循環通入空氣或富含二氧化碳的空氣。有些化學自養生物是好氧的，以氧作為最終的電子受體，並從各種無機電子供體的呼吸中獲取能量，而其他微生物則進行厭氧呼吸，使用氧以外的無機最終電子受體。異養（=同化有機碳源）微生物也需要二氧化碳。許多生活在血液、組織或腸道中的細菌適應比一般空氣中更高的二氧化碳含量。因此，這些細菌需要在含 10%（vol）二氧化碳的大氣中培養。養光性細菌是必須的厭氧菌，利用光能進行一連串的反應，將二氧化碳轉換成磷酸三糖及其他細胞成分。儘管二氧化碳是被循環而非同化，幾乎所有成長中的細胞都絕對需要足夠的 pCO2。因此，重要的是要注意二氧化碳的移除（例如透過 KOH 吸收）會抑制幾乎所有細菌的生長。
微生物培養方法& 從自然界中分離微生物
微生物可以透過各種技術從其自然環境中分離出來。如果微生物數量頻繁、密集或足夠大，就可以用無菌拭子或迴圈直接取樣，接種到適當的液體培養基或瓊脂平板上。這尤其適用於生物大量存在於局部區域的醫療樣品。有大量微生物的環境樣本，例如土壤，也可以直接加入適當的培養基。如果微生物不常出現，則需要預先停止富集。這可藉由過濾樣本，並將過濾器放入適當的培養基中培養來達成。過濾通常應用於液體樣品 (例如河水和海水) 以及空氣取樣時。環境樣本的原位取樣涉及到埋藏玻片法或埋藏毛細管法等技術，在這些技術中，塗有適當介質的顯微鏡玻片或毛細管被埋藏在自然環境（土壤或沉積物）中，經過一段時間後才被取回。然後，將顯微鏡片或毛細管加入新鮮的培養基，再進行生物的分培。這些方法適用於生長緩慢、需要特殊條件的生物，或需要將對環境的干擾減至最低的情況。
所有樣本都可以使用任何一種微生物培養方法進行亞培養。
圖 3.
微生物的分類學和鑑定法
分類學是將個體分類為群體的理論和實踐。分類學有三種方法：
數字分類學
其定義為"根據分類單位的特徵，以數字方法將其歸類為類群"。這包括使用一系列生化和培養測試來研究細菌的所有生理特性，例如：降解有機化合物的種類、對各種維生素或輔酶的需求、染色反應，以及抗生素對生長的抑制作用。這些結果會在電腦上進行編碼，並以樹枝圖表達個體之間的關係。這種分類方式並不會提及細菌菌株之間的進化關係。
化學分類
在這裡，個體的分組是根據假定從共同祖先遺傳下來的一系列特徵來進行的。在化學分類學中，根據細菌結構成分之間的化學相似性來對細菌進行分類。最常用的材料是蛋白質，因為蛋白質是進化過程中保存良好的分子。為了建立共同祖先，化學分類學家通常會分析酵素的主要結構、肽聚糖、細胞質膜及其脂肪酸組成、外層膜及新陳代謝的終產物。
分子分類
這是比較染色體 DNA 或核糖體 RNA 的遺傳序列，以建立相似性模式及族群的系統演化。雖然 DNA 中的嘌呤 (G，鸟嘌呤；A，腺嘌呤) 和嘧啶 (C，胞嘧啶；T，胸腺嘧啶) 碱基含量因個體而異，但在特定物種內卻保持不變。因此，G+C 含量可用於建立分類學關係。
16S或23S核糖體RNA序列之間的相似性也會被比較，以研究細菌群的系統發育。
抗菌藥敏感性測試
化合物的抗菌活性通常是透過測量抑制受試微生物生長所需的最低化合物濃度（MlC-最小抑制濃度）來決定。此測試依靠抗生素在微生物培養基中的擴散來抑制在培養基中或培養基上生長的易感生物的生長。抑制區被視為微生物敏感性的代表。抗生素敏感性多年來一直被用作分類和鑑定的特徵性方法。
厭氧生長
嚴格厭氧的細菌培養會造成特殊的問題，因為這些細菌可能會因為暴露於空氣中而被殺死。培養基中溶解的氧在代謝電子的存在下會形成有毒的自由基和過氧化氫。非嚴重厭氧菌無法解毒這些活性形式的氧。為了讓非嚴重厭氧菌在固體培養基上生長，厭氧罐與產生氣體的 "Gas-Paks"一起使用，Gas-Paks"會釋放 CO2 and H2。氫氣在鈀催化劑的作用下與氧發生反應，生成水，從而去除罐中的氧。
氧化還原電位（O/R 電位）
這是介質中氧化分子與還原分子的比例：例如，當氧氣溶解在介質中時，存在的有機化合物會變得更氧化，介質就會呈現正的氧化還原電位。當微生物生長消耗氧氣時，培養基的氧化還原電位就會趨向負值。嚴格的厭氧菌需要在生長過程中將培養基保持在非常低（負）的氧化還原電位。為了達到此目的，在高壓滅菌前會在培養基中加入還原劑。常用的還原劑為硫代乙醇酸鈉 (HS-CH2COONa) 或亞硫酸鈉，它們很容易將質子捐給其他化合物。氧化還原電位、pH 值和微生物生長之間的關係說明如下。
圖 4.
圖五
Serial Dilutions（連續稀釋法）
接種物在連續的稀釋管中稀釋，並將其培養。
最可能菌數法
一種統計方法可以估計用來稀釋系列的接種物中最可能存在的細菌數。使用不同的接種物初始體積製作數個稀釋系列；結果記錄為一系列陽性，即在試管中生長，然後可以計算出 MPN。
直接顯微鏡觀察
使用特別製作的顯微鏡玻片，玻片上有已知容積的淺井和蝕刻在玻璃上的網格。在淺孔中注入細菌懸浮液，測定每個方格中細菌的平均數量，然後將其乘以一個因子，得出每毫升的計數。選擇性染色（使用螢光染料）可用於區分環境樣本中的細菌與非生物。
渾濁度（光密度）
液體培養基的渾濁度會隨著細菌繁殖而增加，可用分光光度計測量。在標準條件下，到達檢測器的光量與細菌數量成反比。樣品的吸光率（光密度）取決於細胞數量、細胞大小和形狀，可用來繪製細菌生長圖。如果將吸光度讀數與相同培養物的直接計數、其蛋白質含量或乾物質相匹配，則可將相關結果用於日後直接根據渾濁度測量估算細菌數量或生物量。
代謝活性
另一種估算細菌數量的間接方法是使用族群的代謝活性。測量代謝產物的數量，並假設其與存在的細菌數量成正比。代謝產物的例子包括 CO2 和有機酸。吸氧量也可以用還原試驗來測量，例如使用亞甲基藍染料，其顏色在有氧時由藍色變為無氧時的無色。
保存細菌培養物
冷藏
可用於短期保存。瓊脂斜面上的培養物或刺穿培養物在 4 °C 儲存時可存活數月。平皿必須密封，以防止其變乾的趨勢。要長時間保存培養物，通常採用兩種方法：
深度冷凍
將純的細菌培養物懸浮在液體中，並在 -50 °C 至 -95 °C 的溫度下快速冷凍（通常使用液氮）。敏感的微生物需要甘油 (最終濃度 15-20 %)，甘油可作為防凍劑，或額外的蛋白質 (脫脂奶粉) 來保護它們。
凍乾
將細菌懸浮液快速冷凍，並透過高真空除去水分。微生物可在這些粉末狀殘渣中存活數年，並可隨時透過在營養培養基中重新水化培養物而復活。從菌株庫中訂購的菌株通常以這種形式交付。
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