使用 Ascentis® Express C18 色谱柱优化各种基质中的大麻素高通量分析
Seamus Riordan-Short, Senior Chemist1, Yevgen Kovalenko, Technician1, Matthew Noestheden, Director of Operations1, Jennifer King, Program Marketing Manager2, Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison2
1Supra Research and Development, 2Merck
伴随大麻和工业大麻相关法规日益完善，对准确和精密的药效定量检测方法的开发和验证需求随之增加。大麻素带来了许多挑战，且需额外处理各种类型的基质。HPLC/UV 是最常用的技术，但必须优化 HPLC 参数，确保多次进样及处理各种样品类型中均可保持良好的分离度和稳定的保留时间。
位于加拿大不列颠哥伦比亚省基洛纳的 Supra Research and Development (“SupraRnD”，www.suprarnd.ca) 科学家开发出了一种适用于各种基质、可靠的高通量大麻素分析方法。SupraRnd 于 2015 年开始涉足大麻检测，并在当年获得加拿大卫生部的大麻产品检测许可证。2018 年，他们成为加拿大首批获得 ISO 17025 大麻检测认证的实验室之一。他们的效力测定方法随着时间的推移不断发展，以满足客户不断变化的需求，且已针对几种不同基质进行了验证。
实验条件
将全花样品放入密封袋中，在 -80 °C 下冷冻至少 30 分钟，然后立即均质化。*分析大麻花时，对代表性样品进行均质化和二次取样至关重要，因为给定植物之间及自身内部的大麻素浓度可能存在差异悬殊。后续工作流程包括用甲醇简单提取 0.2 g 样品，然后对提取物进行超声处理并在 -20 °C 下稳定 1 小时。随后对样品离心，并 100:1 稀释上清液等待 HPLC 分析。小样本量和分析前稀释相结合，可最大限度减少发生基质相关问题（例如干扰、色谱柱寿命等）的概率。HPLC 分析环节的进样周期为 8 分钟。即可以每 8 小时间隔进样 60 次，在同一班次运行更多客户样品。已通过该方法分析的大麻素请见表 1。
大麻素HPLC分析
最终优化的 HPLC 参数请见表 2。
开发该方法时，考虑了以下因素：
- 所有 17 种化合物的色谱分离度。
- 总循环时间（即运行时间+平衡时间）不到 10 分钟。
- 维持一致性能的稳健方法
- >1000 次进样，保留时间稳定，同时保持良好的峰形和响应灵敏度。
- 适用于不同基质，如花、巧克力、软膏、油、浓缩物等。
方法校准
方法校准浓度范围为 0.01 µg/mL 至 40 µg/mL。因此某些样品需要高度稀释，确保处于此分析范围内。进行校准和加标时，使用了Cerilliant®有证标准物质 (CRM)。取 1 mg/mL 各大麻素 CRM（CBLA 除外，为 0.5 mg/mL）与内标溶液一起用 HPLC 流动相组分 A 直接稀释，制备 17 种组分的 40 µg/mL 原液。然后用 HPLC 流动相 A:B 的 30:70 混合物中进一步稀释此原液，获得更低浓度的校准标准液。
HPLC 色谱柱：Ascentis® Express C18
分析所用的 HPLC 色谱柱是 Ascentis® Express C18柱，15 cm x 2.1 mm I.D.，2 µm。Ascentis® Express 色谱柱包含具有实心核和多孔壳结构（也称为表面多孔）的 Fused-Core® 颗粒。相对于同尺寸的全多孔颗粒，这种颗粒结构可提供更高的分离效率，且可在更低的压力下实现更短的分析时间，比使用更小尺寸的全多孔颗粒（< 2 µm）方法更有效。Ascentis® Express 色谱柱的颗粒结构允许使用较大的颗粒，同时适合传统系统和 UHPLC 系统。在此方法中，SupraRnD 使用 UHPLC 系统，也可通过适当优化仪器在传统系统上成功分离。具体而言，这需要最大限度降低系统分散度。为此，需要通过减少色谱柱入口和出口处的管道长度和内径——对于 UV 检测器，可以使用体积 < 5 µL 的流通池。
方法验证和性能
选择 Ascentis® Express C18 进行方法验证之前，SupraRnD 筛选了来自不同制造商的其他六种化学成分的色谱柱。他们使用多各色谱柱均能实现所需的色谱分离度和较短的运行时间，但发现 Ascentis® Express C18 是唯一保留时间稳定的色谱柱——尤其是在处理酸性大麻素时。如图 1所示，图示为进样 #1 和进样 #1140 时的校验标准品色谱图，其间运行了大量样品提取物。
图 1.Ascentis® Express C18 色谱柱上的大麻素标准品；进样#1和进样#1140 对比。
Ascentis® Express C18 方法针对几种不同的基质中进行了验证，包括啤酒花（作为大麻的替代基质）、大麻籽油、CBD 浓缩物和外用软膏。在 0.05 至 20% 加样范围内，啤酒花的回收率为 85-115%（按重量计）。表 3总结了这一验证以及其他基质。此方法达到的大麻素（CBDV、CBG、CBD 和 CBC 除外，浓缩物）报告限值 (MRL) 均为 0.05 wt.%。所有基质的重现性（% RSD）< 4%。通过效力检测进行进一步评估，该方法成功通过了大麻花和大麻油样品效力验证。
*由于产生的含量较高，未定量 CBD 回收率
**由于产生的含量较高，未定量 Δ9-THC 回收率
基质中产生的 CBDV、CBG、CBD、CBC 问题导致无法计算这些化合物的 MRL
图 2显示了加样 1% w/w 且 MRL 浓度为 0.05% w/w 的啤酒花的色谱图示例。 在加样极低的情况下，基质干扰更加明显，所有 17 种大麻素均可从背景峰中区分并进行分析。紧邻 THCV 和 CBL 洗脱的特定干扰物可能是由于啤酒花样品中存在特定萜烯所致。大麻花中未观察到这些峰。在加样大麻膏样品中（图 3），所有大麻素均通过 MRL 清晰检出。
图 2.啤酒花，加样 1% 大麻素。
啤酒花，加样 0.05% 大麻素。
图 3.由大麻提取物制成的软膏，加样 0.05%（按重量计）。
迄今为止，单根 Ascentis® Express C18 色谱柱已进行超过 1,550 次进样。SupraRnD 指出，到目前为止，色谱柱背压未明显增加，性能也没有下降。使用过程收集的数据显示，背压净增 2%。他们还指出，稳定的保留时间让他们更有信心鉴别样品中的大麻素峰。图 4中的实例比较了两种不同的基质：黑巧克力和大麻花。两份样品都含有可测水平的 Δ9-THC，且两个基质之间的保留时间差异很小。
图 4.黑巧克力和大麻花样品（未加样）的洗脱模式对比。
结论
评估多种 HPLC 色谱柱后，SupraRnD 成功开发了一种使用 Ascentis® Express C18 色谱柱分析各种基质中 17 种大麻素的稳健方法。迄今为止，该方法已成功应用于五种样品类型，包括花、大麻膏、巧克力、浓缩物和软糖。最终方法选择 Ascentis® Express C18 色谱柱，是因为其重复使用保留时间稳定且可保持大麻素色谱性能。此外，目前使用的色谱柱在超过 1500 次进样的过程中显示出背压增加极小。
* 公布上述数据后，SupraRnD 取消了冷冻步骤，并在室温下均质化了全花。此举旨在减少由于大气中的水凝结到冷样品上而导致水分含量增加的可能性。
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