跳轉至內容
Merck
首頁原代細胞培養技術冷凍保存的 PBMC 可保持表型和功能

冷凍保存的 PBMC 可保持表型和功能

冷凍（cryopreserved）的外周血單核細胞（PBMCs）比新鮮的PBMCs有許多優點，研究人員可以提前規劃實驗，使用即用型細胞，這些細胞可以儲存在冷凍庫中，直到需要時才取出。冷凍細胞的一個顧慮是冷凍保存可能導致的活力、表型或功能損失。我們在此報告 BioIVT 冷凍 PBMC 的特性，並透過測量成熟 T 細胞活化標記 (CD25 和 CD69) 的表達水平，直接比較 T 細胞活化反應。資料顯示，這些冷凍的 PBMCs 在冷凍保存期間維持活力和表型。在抗 CD3 和抗 CD28 抗體刺激下，T 細胞雖然遲緩，但仍顯示出適當的活化反應。在以細胞為基礎的實驗和免疫學研究中，有功能、有活力的冷凍PBMCs為新鮮PBMCs提供了方便的替代品。

冷凍 PBMC 表徵

首先使用碘化丙啶染色評估冷凍 PBMC 的存活率，並使用針對下列蛋白質標記的螢光抗體進行流式細胞計測：

  • CD14 (單核細胞標記)
  • CD56 (NK細胞標記)
  • CD4 (T輔助細胞亞群)
  • CD8（T 細胞亞群）
  • CD19 （B 細胞）

所有實驗均使用來自三位健康捐獻者的冷凍保存 PBMCs。圖 1中顯示了具有代表性的數據。表 1總結了存活率和組成結果。平均細胞存活率確定為 91.8%（圖 1.A.）。每個細胞群的表型組成（以選定細胞群的百分比表示）（見圖 1.B.）與預期值一致。結果顯示，這些冷凍的 PBMC 在冷凍保存和解凍過程中保持了活力和表型。

冷凍保存的 PBMCs 的特性。

圖 1.A)用碘化丙啶染色法和流式细胞术测定冷冻 PBMC 的存活率。計算出的細胞存活率（三個樣本的平均值）為 91.8%。 B)冷凍 PBMC 的表型分析。分析CD45+細胞的CD14、CD19和CD8/CD4表達，以分別確定單核細胞、B細胞和T細胞的組成。對於 NK 細胞，則使用 CD56 染色。表列結果如表 1所示。

表 1.冷凍 PBMCs 的活力和組成。如圖 1.B所示，所有細胞群都是以淋巴細胞和單核細胞的大小及 CD45+ 表達來篩選。使用 CD4+ 和/或 CD8+ 的組合門檻進一步篩選 T 細胞。使用三個健康捐獻者的冷凍 PBMCs。結果表示流式細胞計測定的平均值和標準差。

外周血單核細胞與 T 細胞活化

外周血單核細胞由淋巴細胞 (T 細胞、B 細胞、NK 細胞) 和單核細胞組成。這些細胞會給予免疫系統選擇性的反應，是免疫的關鍵角色。T 細胞主要透過 T 細胞受體 (TCR) 複合物介導的細胞外訊號活化。研究顯示，某些激發劑（如 CD3 和 CD28 抗體）可觸發 TCR 訊號，透過細胞表面標誌物表達的變化來觀察，類似於透過抗原刺激實際活化 TCR。T 細胞活化會導致 CD25 表達增加，CD69 表達也會暫時增加（圖 2）。因此，CD25 和 CD69 細胞表面標記可用來衡量 T 細胞的活化和功能。

活化的 T 細胞表達。

圖 2.活化的 T 細胞顯示 CD25 表達增加，CD69 表達也暫時增加。

為了確定這些凍結的 PBMC 是否保留其功能，我們使用流式細胞計測量 CD25 和 CD69 在抗 CD3 和抗 CD28 抗體刺激後的變化。實驗使用新鮮和冷凍的 PBMCs 進行。

CD25表達

在三個獨立實驗中處理了PBMC樣本。在每個實驗中，使用兩個來自不同供體的新鮮細胞樣本和兩個來自不同供體的冷凍細胞樣本，比較細胞表面標記的表達。使用含有抗CD3 (3 µg/ml)和抗CD28 (1 µg/ml)抗體的RPMI(+)培養基活化細胞。不含活化抗體的 RPMI(+) 培養基用作基線對照。在活化後的指定時間點用螢光標記抗CD25抗體染色細胞，並在同一天用流式細胞儀分析（圖3）。為了進行分析，使用正向散射區和側向散射區對淋巴細胞群按大小進行分選。然後使用 CD45+ 表達對淋巴細胞進行分選，並使用 CD4+ 和/或 CD8+ 的組合門對 T 細胞進行分選。

正如所料，用抗CD3和抗CD28抗體活化後，新鮮和冷凍的PBMCs都顯示T細胞CD25表達增加。與活化後的冷凍細胞相比，新鮮細胞顯示出更大的 CD25 表達初始增加，儘管在第 1 天和第 3 天仍然觀察到冷凍細胞的強勁反應。更長時間的培養會導致新鮮細胞和冷凍細胞的 CD25 表達有更大的增加。

冷凍保存的 PBMCs 中活化 T 細胞的 CD25 表達。

圖 3.活化後 24 小時(A)或 72 小時(B)的 CD25 表達，每個時間點都有供體匹配的未活化對照樣本。A-B)代表性直方圖，細胞以 CD45+ WBC 及 CD4+ 或 CD8+ T cells 分選。C) 表達 CD25 的細胞群百分比的變化，以捐贈者匹配活化與未活化樣本（新鮮 PBMCs，n = 2；冷凍 PBMCs，n = 4）之間的差異計算。 D) 描述 C 圖表中數值的表格。

CD69的表達

實驗和選通策略如CD25所述，使用螢光標記抗CD69抗體代替螢光抗CD25抗體。結果顯示於 圖4。正如所料，在抗CD3和抗CD28抗體活化後，新鮮和冷凍的PBMCs都顯示T細胞CD69表達增加。與活化後的冷凍細胞相比，新鮮細胞再次顯示出更大的 CD69 表達初始增加，儘管冷凍 PBMCs 仍觀察到可察覺的反應。對於 CD69，新鮮細胞和冷凍細胞在活化後一天與活化後三天都觀察到明顯較大的反應。這與預期的 CD69 細胞表面標記的瞬間反應相符。

冷凍 PBMC 活化 T 細胞的 CD69 表達。

圖 4.CD69在活化後24小時(A)或72小時(B)的表達，每個時間點都有供體匹配的未活化對照樣本。 A-B)代表性直方圖，顯示的細胞以CD45+白細胞和CD4+或CD8+T細胞為門控。C)表达 CD69 的细胞群百分比的变化，以供体匹配激活和未激活样本（新鲜 PBMCs，n = 2；冷冻 PBMCs，n = 4）之间的差值计算。 D)描述 C 中图表值的表格。

冷凍 PBMC 功能彙總

功能結果彙總於 圖 5。CD25和CD69標記表達的變化模式符合新鮮和冷凍PBMC樣本的預期反應。根據 CD25 和 CD69 標記表達的變化，冷凍的 PBMC 比新鮮的 PBMC 表現出較弱的初始活化。儘管如此，冷凍細胞在活化後 24 小時和 72 小時仍可觀察到可察覺的反應。這些數據顯示，冷凍的 PBMC 在冷凍保存後仍能保持活力、表型和功能，為大多數應用提供了方便、即用型的新鮮細胞替代品。

冷凍保存的 PBMCs 的功能活性。

圖 5.根據 CD25 和 CD69 標記表達的變化，比較新鮮和冷凍 PBMC 的活化情況的資料摘要。儘管冷凍細胞的反應較弱，但資料顯示這些冷凍的 PBMCs 仍保留其功能。

材料與方法

材料

細胞解凍和處理

  1. 將冷藏的 PBMC 小瓶在 37 °C 水浴中解凍 2-5 分鐘。
  2. 在冷藏和新鮮的 PBMC 中加入 RPMI(+) 培養基。
  3. 移去上清液。
  4. 將細胞重懸於 RPMI(+) 培養基。
  5. 在血球計上點算細胞，以每孔 200 µl 的容量將 100,000 活細胞培養到 96 孔板中。注意：樣本將重悬於含抗CD3（3 µg/ml最終濃度）和抗CD28（1 µg/ml最終濃度）的RPMI(+)培養基，用於刺激和活化反應；或僅用RPMI(+)培養基，用於非活化樣本。

流式細胞計上的細胞染色和分選

  1. 所有洗滌步驟都使用 FACS 緩衝液。
  2. 按照 「細胞解凍和處理 」部分所述，從 96 孔板中的樣品開始。
  3. 在每個微離心管中加入 1 ml FACS 緩衝液。
  4. 將微離心管以 300 x g 離心 5 分鐘。確保細胞形成顆粒。
  5. 將上清液移至微離心管上的 50 µl 線。
  6. 加入針對所需細胞表面標記的螢光劑標記抗體，室溫下暗處培養 40 分鐘。
  7. 將每個微離心管的全量（約 300 µl）轉移至 96 孔 U 底板，使用 Guava® easyCyte™ 8HT 流式細胞儀進行分析。

來自 BioIVT 的冷凍 PBMC 和免疫細胞產品

我們很榮幸提供來自 BioIVT 的冷凍 PBMC。

Loading

 

檢視我們的正常 PBMC、疾病狀態 PBMC 和 BioIVT 免疫細胞亞群的完整清單。

登入以繼續

若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。

還沒有帳戶？