Sanger 測序步驟與方法

什麼是桑格測序？

桑格測序又稱為 「鏈終止法」，是一種測定 DNA 核苷酸序列的方法。該方法由兩次諾貝爾獎得主 Frederick Sanger 及其同事於 1977 年開發，因此稱為 Sanger 序列。

回顧 DNA 的一般結構，請參閱 圖 2。

桑格測序如何進行？

桑格測序可以手動進行，或更常見的是透過測序機自動進行（圖 1）。每種方法都遵循以下三個基本步驟。

圖 1. 自動 Sanger 測序的三個基本步驟。

Sanger 測序步驟

Sanger 測序主要有三個步驟。

1.DNA Sequence For Chain Termination PCR

感興趣的 DNA 序列被用作一種特殊類型的 PCR 稱為鏈式終止 PCR。鏈式終止 PCR 的工作原理與標準 PCR 無異，但有一個主要差異：加入稱為二脫氧核醣核苷酸 (ddNTP) 的修飾核苷酸 (dNTP)。在標準PCR的延伸步驟中，DNA聚合酶通過催化最後一個核苷酸的游離3「-OH基團與下一個核苷酸的5」-磷酸之間形成磷酸二酯鍵，將dNTPs添加到生長的DNA鏈中（圖2）。

在鏈終止PCR中，用戶在PCR反應中將低比例的鏈終止ddNTP與普通dNTP混合。ddNTP缺乏磷酸二酯鍵 形成所需的3'-OH 基團；因此，當DNA聚合酶隨意加入一個ddNTP時，延伸就停止了。鏈終結 PCR 的結果是數百萬到數十億個 DNA 序列的寡核苷酸拷貝，以 5'-ddNTP 隨機的長度 (n) 終結。

在 手動 Sanger 測序中，會設定四個 PCR 反應，每個反應只混入單一種 ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP 和 ddCTP）。

在 自動化 Sanger 測序中，所有 ddNTP 都混合在單一反應中，四種 dNTP 中的每一種都有獨特的螢光標籤。

2.透過凝膠電泳進行大小分離

在第二步中，鏈端寡核苷酸會透過凝膠電泳進行大小分離。在凝膠電泳中，DNA 樣本被載入凝膠基質的一端，然後通入電流；DNA 帶負電，因此寡核苷酸會被拉向凝膠對面的正電極。由於所有 DNA 片段的單位質量都帶有相同的電荷，因此寡核苷酸的移動速度僅取決於其大小。片段越小，在凝膠中移動時受到的摩擦就越小，移動速度就越快。

在 手動 Sanger 測序中，來自四個 PCR 反應的寡核苷酸會在凝膠的四個獨立通道中運行。

在 自動化 Sanger 測序中，所有寡核苷酸都在測序機內的單一毛細管凝膠電泳中運行。

3.凝膠分析& DNA序列的判定

最後一步驟只是閱讀凝膠來判定輸入DNA的序列。因為 DNA 聚合酶只會從提供的引物開始，以 5「 到 3」 的方向合成 DNA，所以每個末端 ddNTP 都會對應原始序列中的特定核苷酸（例如、最短的片段必須終止於從 5「 端開始的第一個核苷酸，第二短的片段必須終止於從 5」 端開始的第二個核苷酸，等等）。因此，通過讀取從小到大的凝膠帶，我們可以確定原始 DNA 鏈的 5「 到 3」 序列。

在 手動 Sanger 測序中，使用者會一次讀取凝膠的所有四條泳道，由下至上，利用泳道來判定每條帶的末端 ddNTP 的身分。例如，如果在與 ddGTP 相對應的一列中發現最下面的帶，則最小的 PCR 片段以 ddGTP 結尾，原始序列 5' 端起的第一個核苷酸有一個鸟嘌呤 (G) 基。

在 自動化 Sanger 測序中，電腦會依序讀取毛細管凝膠的每條帶，利用螢光來呼叫每條末端 ddNTP 的身分。簡而言之，雷射激發每一條帶上的螢光標籤，然後電腦偵測所發出的光。由於四個 ddNTP 都有不同的螢光標籤，因此所發出的光可直接與末端 ddNTP 的身分掛鉤。輸出的結果稱為色譜圖，沿著模板 DNA 的長度顯示每個核苷酸的螢光峰。

圖 2. DNA 結構示意圖。DNA 是一種由兩條鏈組成的分子，兩條鏈互相纏繞形成雙螺旋。每條鏈由一串稱為脫氧核醣核苷酸 (dNTP) 的分子組成。

每個 dNTP 包含一個磷酸基團、一個糖基團和四個含氮碱基之一 [腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T)、鸟嘌呤 (G) 或胞嘧啶 (C)]。這些 dNTP 藉由一個 dNTP 的糖和下一個 dNTP 的磷酸基之間的磷酸二酯共價鍵，以線性方式串連在一起；這種重複的糖-磷酸模式構成糖-磷酸骨架。

兩條獨立鏈的含氮碱基藉由互補碱基之間的氫鍵結合在一起，形成雙鏈 DNA 螺旋。

如何讀取 Sanger 測序結果

正確讀取 Sanger 測序結果取決於兩條互補 DNA 鏈中哪一條是您感興趣的，以及有什麼引物可用。如果 DNA 的兩條鏈是 A 和 B，而 A 鏈是我們感興趣的，但引物對 B 鏈較好，則輸出的片段會與 A 鏈相同；另一方面，如果 A 鏈是我們感興趣的，而引物對 A 鏈較好，則輸出的片段會與 B 鏈相同。

因此，如果感興趣的序列讀取 "TACG「，而引物最適合該鏈，則輸出將是 」ATGC「，因此必須轉換回 」TACG"。但是，如果引物更適合互補鏈 ("ATGC「)，那麼輸出就會是 」TACG"，這是正確的序列。

簡而言之，在開始之前，您需要知道您的目標是什麼，以及您要如何達成目標！因此，請牢記這一點，以下是前一個範例（TACG -> ATGC -> TACG）。如果二離子核苷酸的標籤是 T = 黃色、A = 粉紅色、C = 深藍色、G = 淺藍色，您最後會得到引物-A、引物-AT、引物-ATG 和引物-ATGC 等短序列。片段經由電泳分離後，雷射會依序讀取片段的長度（粉紅色、黃色、淺藍色和深藍色），並產生色譜圖。電腦會轉換字母，因此最後的序列就是正確的 TACG。

桑格測序 vs. PCR

桑格測序和 PCR 使用相似的起始材料，可以互相搭配使用，但兩者都無法取代對方。

PCR用來完整地擴增 DNA。雖然可能會意外產生長度不一的片段（例如 DNA 聚合酶可能會脫落），但我們的目標是複製整個 DNA 序列。

相較之下，Sanger 測序的目標是產生每個可能的 DNA 長度，直到目標 DNA 的完整長度。

Sanger測序和PCR在產生Sanger測序方案的起始材料時可以結合起來。

如果有一個以上的模板，Sanger 測序就會更有效率。如果目標序列長 1,000 個核苷酸，而模板只有一個拷貝，那麼產生 1,000 個標籤片段就需要較長的時間。但是，如果模板有多個拷貝，理論上生成全部 1,000 個標籤片段所需的時間會更短。