CRISPR RNP 基於基因組編輯的應用
雖然 CRISPR 系統可以透過質粒傳遞到細胞中，但直接引入 Cas9 RNP 可消除質粒 DNA 整合到宿主基因組中的可能性，從而加強和擴大 CRISPR 基因組修飾技術的應用。RNP 復合物可提供更快速的基因編輯，因為功能性核酸酶可立即在細胞中使用，而且復合物會快速降解和清除，使編輯活性變得短暫。縮短 RNP 在細胞中的可用時間可減少脫靶效應。
圖 1.具有 Cas9 蛋白的 CRISPR 一部份和二部份系統示意圖，展示核糖核蛋白 (RNP) 的組成。在產生雙鏈斷裂之後，細胞 DNA 機器會採取兩種可能的修復途徑：非同源末端接合 (NHEJ)、Indel 形成或針對性插入或敲入的同源定向修復 (HDR)。
詳細方案
我們的合成指南與廣泛的基因編輯應用相容。無論您需要的是一般使用指南、胚胎的核感染及顯微注射、T 細胞編輯或 iPSC 協議。您也可以在下游裂解效率評估、克隆分離 & 篩選和故障排除方面找到幫助。
使用 RNP 進行原代 T 細胞編輯
以核酸核蛋白 (RNP) 為基礎的基因組編輯實驗從未像 Sigma-Aldrich® 合成 合成導向 RNA 和 Cas9 蛋白那樣容易，然而有些細胞可能比其他細胞更難編輯。我們已經廣泛地驗證了我們的試劑和協議，可以在最具挑戰性的應用中工作，包括在原代 T 細胞中，當嘗試敲入或敲除一個構建或基因時，需要克服許多重大的挑戰。然而，使用 sgRNA，可以在原代人類 T 細胞中實現編輯，其效率和特異性超過了兩部分導向系統（以下數據表的圖 2 ）。sgRNAs 可以作為高度特異性的成對缺口酶和 Cas9 缺口酶導入，或作為單位點 SpCas9 蛋白質導入，以獲得 PD-1 基因的完全敲除，通過 PD-1 表達和 NGS 測定（以下資料表的圖 2 ）。sgRNA 可以快速設計成任何基因的單一目標 RNA 或成對缺口酶系統的一部分，非常適合各種人類細胞類型，包括原代 T 細胞。Cas 核酸酶以蛋白形式遞送，預先與單一、經修訂的導向 RNA (gRNA) 複合，而不是編碼在質粒上，可讓研究人員繞過 CRISPR 在治療領域中使用的歷史限制因素，即非靶向效應、低效率以及細胞對外來 DNA 的不良反應。當您需要確定時， Sigma-Aldrich® sgRNAs 是唯一有 100% 性能保證的導向 RNAs --預先設計的 和 定制序列。
圖 2.使用 RNP Nickase 系統進行編輯，只有單一活性切割域，然後與近端導向 RNA 成對遞送，可以精確地進行雙鏈斷裂，並在較難編輯的細胞類型中提供超特異和高效的基因組編輯。
在小鼠胚胎中經過驗證的高性能基因編輯
創建小鼠模型是一個勞動密集和昂貴的過程，但它對了解健康和疾病的基礎研究至關重要。Sigma-Aldrich® sgRNA 的性能經過測試 ，在小鼠胚胎中的多個基因組位點，將我們的 sgRNA 與其他頂尖提供商的 sgRNA 進行比較，以測試我們的 sgRNA 在小鼠胚胎中基因組工程應用的最高水準。
Sigma-Aldrich® sgRNA 與其他頂尖供應商之間在每個位點的多個複製並排比較顯示了相同 sgRNA 目標之間編輯效率的差異。另外，Sigma-Aldrich®sgRNA 對胚胎存活率的毒性沒有增加。 總的來說， 數據顯示我們的高活性和高純度 sgRNAs 在獨立機構進行的實驗中提供了優於競爭對手的基因編輯效果，而無需對胚胎進行顯微注射或電穿孔。
圖 3.傳統上，在小鼠胚胎中進行基因編輯是一個漫長的過程，然而，使用 CRISPR 進行基於 RNP 的編輯可以降低複雜性。小鼠模型可以快速產生，幾乎適用於任何目標。我們合成的 sgRNA 適用於胚胎的顯微注射和電穿孔。
相關產品
表 1：Cas9 蛋白產品
表 2: 其他相關產品
。疑難排解
如果沒有觀察到切削，並且有理由懷疑是實驗缺陷造成的錯誤，以下注意事項可能有助於實驗的疑難排解。
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