碱性磷酸酶

碱性磷酸酶—检测体系、分子量、底物和结构

• 牛碱性磷酸酶
• 大肠杆菌碱性磷酸酶
• 虾碱性磷酸酶

我们提供了广泛的碱性磷酸酶(ALP/ALKP)制剂，可针对ELISA、免疫印迹和组织化学检测应用需求优化与抗体和其他蛋白质的结合。我们的BioUltra级碱性磷酸酶具有非常高的比活性，特别适合需要高灵敏度的蛋白质标记。

蛋白质免疫印迹

图 1. 用抗FLAG抗体和ALP标记的二抗检测FLAG-BAP对照蛋白，并用BCIP / NBT底物（使用ProteoQuest 免疫印迹试剂盒（比色法），B6404）进行染色。

免疫组化

图 2. 用单克隆抗人IgA（克隆GA-112，货号I0636）以及SIGMAFAST™ Fast Red TR/Naphthol AS-MX片剂（货号F4523）底物，用单克隆抗人 IgA 和抗小鼠 IgG ALP 偶联物对福尔马林固定、石蜡包埋的人扁桃体切片进行染色。40x

我们的产品还可用于脱磷酸化酪蛋白和其他蛋白质。ALKP可用于DNA或RNA 5’端的脱磷酸化以防止自连。DNA或RNA在通过ALKP脱磷酸化后也可标记放射性的磷酸盐（通过T4多核苷酸激酶）。

牛碱性磷酸酶

牛肠ALP是一种膜来源的二聚体糖蛋白。^1-3至少存在三种异构体，每种单体通常具有两个N-连接的和一个或多个O-连接的聚糖。² 该酶需要锌和二价镁或钙离子才能激活。⁴

该酶对醇、胺、焦磷酸盐和酚类的磷酸酯具有广泛的特异性，通常用于蛋白质和核酸的脱磷酸化。^5-7

K_M：1.5 × 10^–3 M (p-硝基苯磷酸酯),19 × 10^–3 M (磷酸烯醇式丙酮酸)

分子量：^2,3 140–160 kDa (二聚体MW)
E₂₇₈1%：7.6–10.5
等电点：^4,8,9 同工酶在4.4–5.8之间

最适pH：该酶最稳定的pH值范围为7.5–9.5.³最佳酶活的pH值是8-10。最适pH值也取决于底物、底物浓度和离子浓度的变化。⁸本产品的酶活是在pH值为9.8时进行测定的（二乙醇胺缓冲液酶检测法）。

温度对于活性和稳定性的影响

牛碱性磷酸酶的抑制剂

螯合剂、砷酸盐、半胱氨酸、碘、无机磷酸盐、焦磷酸盐、异丙磷、磷酸三苯酯、氟磷酸二和L-苯丙氨酸。^9,10

左旋咪唑（货号L9756）通常用来抑制内源性ALKP活性，而对于肠酶只有轻量的抑制作用。^11,12

检测实验方案

• 二乙醇胺检测
  
• 甘氨酸检测 pH 8.8
• 甘氨酸锌检测
  
• 甘氨酸检测 pH 10.4
  

单位定义：在pH 9.8、37 °C条件下，一单位DEA每分钟可水解1 µmole 的4-硝基苯基磷酸酯。3单位DEA近似于1单位甘氨酸。

ALP还可用于确定巴氏杀菌对牛奶和奶酪等乳制品的有效性。ALP在约 72°C至少15秒时发生变性。非极端温度条件已被证明能破坏牛奶中的大多数病原体。因此，ALP活性可以用来测量巴氏杀菌的有效性。在过去，有两种方法被用于检测巴氏杀菌后的ALP活性，第一种是通过释放并检测苯酚的Scharer检测法；而第二种方法被称为Aschaffenberg & Mullen检测，通过检测对硝基酚的释放。两种检测都呈现阴性结果则表明ALP完全失活以及大多数乳生病原体的破坏。最近，基于同样ALP活性原理也开发出了新的更灵敏的技术。

参考文献

1. Hsu HH, Munoz PA, Barr J, Oppliger I, Morris DC, Vaananen HK, Tarkenton N, Anderson HC. 1985. Purification and partial characterization of alkaline phosphatase of matrix vesicles from fetal bovine epiphyseal cartilage. Purification by monoclonal antibody affinity chromatography. J. Biol. Chem..(260):1826-31.

2. NEUMANN H, LUSTIG A. 1980. The Activation of Alkaline Phosphatase by Effector Molecules. A Combined Kinetic and Hydrodynamic Study. Eur J Biochem. 109(2):475-480. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04818.x

3. Fosset M, Chappelet-Tordo D, Lazdunski M. 1974. Intestinal alkaline phosphatase. Physical properties and quaternary structure. Biochemistry. 13(9):1783-1788. https://doi.org/10.1021/bi00706a001

4. Besman M, Coleman JE. 1985. Isozymes of bovine intestinal alkaline phosphatase. J Biol. Chem..(260):11190-3.

5. Fernley H. 1971. 18 Mammalian Alkaline Phosphatases.417-447. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60378-9

6. Morton RK. 1955. The substrate specificity and inhibition of alkaline phosphatases of cow's milk and calf intestinal mucosa. 61(2):232-240. https://doi.org/10.1042/bj0610232

7. Morton RK. 1955. The action of purified alkaline phosphatases on di- and tri-phosphopyridine nucleotides. 61(2):240-244. https://doi.org/10.1042/bj0610240

8. Latner AL, Parsons M, Skillen AW. 1970. Isoelectric focusing of alkaline phosphatases from human kidney and calf intestine. Enzymologia. 40(1):1-7.

9. Lazdunski M, Brouillard J, Ouellet L. 1965. ÉTUDE DES EFFETS ÉLECTROSTATIQUES SUR LE MÉCANISME D'ACTION CATALYTIQUE DE LA PHOSPHATASE ALCALINE INTESTINALE DE VEAU. Can. J. Chem.. 43(8):2222-2235. https://doi.org/10.1139/v65-300

10. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press.

11. STAGNI N, VITTUR F, DEBERNARD B. 1983. Solubility properties of alkaline phosphatase from matrix vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 761(3):246-251. https://doi.org/10.1016/0304-4165(83)90072-7

12. van Belle H. 1972. Kinetics and inhibition of alkaline phosphatases from canine tissues. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 289(1):158-168. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90118-0

13. Roger DM. 1938. Practical Experience with the Scharer Rapid Field Test for Pasteurization. Am J Public Health Nations Health. 28(11):1325-1327. https://doi.org/10.2105/ajph.28.11.1325

 

大肠杆菌碱性磷酸酶

大肠杆菌碱性磷酸酶是一种非糖基化的二聚体蛋白，主要存在于大肠杆菌的壁膜间隙，并至少有三种异构体存在。该酶的激活需要锌，并由镁离子得以进一步激活。^1-3同牛酶一样，大肠杆菌酶对于磷酸酯具有广泛的特异性。¹

K_M：0.02 × 10^–3 M (对硝基苯磷酸)⁴
分子量：² 89 kDa(二聚体MW)
E₂₇₈1%：7.6–10.527.6–10.5²
等电点：⁵同功酶范围4.5
最适pH：8.0⁵

1. Reid TW, Wilson IB. 1971. 17 E. coli Alkaline Phosphatase.373-415. https://doi.org/10.1016/s1874-6047(08)60377-7

2. Anderson RA, Vallee BL. 1975. Cobalt(III), a probe of metal binding sites of Escherichia coli alkaline phosphatase.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72(1):394-397. https://doi.org/10.1073/pnas.72.1.394

3. Savchenko A, Wang W, Vieille C, Zeikus J. 2001. [26] Alkaline phosphatase from Thennotoga neapolitana.298-305. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(01)31067-4

4. Boulanger RR, Kantrowitz ER. 2003. Characterization of a MonomericEscherichia coliAlkaline Phosphatase Formed upon a Single Amino Acid Substitution. J. Biol. Chem.. 278(26):23497-23501. https://doi.org/10.1074/jbc.m301105200

5. Garen A, Levinthal C. 1960. A fine-structure genetic and chemical study of the enzyme alkaline phosphatase of E. Coli I. Purification and characterization of alkaline phosphatase. Biochimica et Biophysica Acta. 38470-483. https://doi.org/10.1016/0006-3002(60)91282-8

 

虾碱性磷酸酶

虾ALKP是一种二聚体蛋白，通过SDS-PAGE确定其分子量大小约为58kDa。

该虾酶比其他来源酶在较低的温度下即可发生变性，因此建议对DNA和RNA脱磷酸化时，反应后需采取热灭活。

虾碱性磷酸酶，货号A2237

DNA去磷酸化操作步骤