固相合成

多肽是采用固相FMOC或BOC化学法在PEG-聚苯乙烯载体树脂上合成的。合成完成后，先去除侧链保护基团，同时从树脂上切割多肽。随后，将经切割和去保护的多肽材料沉淀、清洗并溶解在含H2O/ACN/HOAC的缓冲液中，然后进行冻干处理。

多肽QC主要由ESI质谱法（确定全长产物）和反相高效液相色谱法（RP-HPLC；测定多肽纯度）来测定。不符合纯度要求的多肽则通过RP-HPLC法进行纯化。

图 1. 固相FMOC

批次间差异

1. 多肽纯度 – 指目标多肽产物相对于所有其他杂质（除水分外）的数量，由分析HPLC来测定。多肽纯度是最常见的差异因素，可能会导致高频率的批次间差异。多肽纯度越高，差异性就越小。纯度较低时每个合成批次所含杂质可能有所不同。在某些情况下，一个或更少氨基酸缺失的多肽杂质可能仍有活性并影响多肽的整体活性。
   
   
2. 聚集 – 疏水性多肽的聚集倾向较高。其活性在很大程度上取决于聚集形式的活性。高浓度多肽也会导致更高的聚集。
   
   
3. 化学转变 - 多肽在储存过程中会经历一系列化学转变，可能导致活性降低。常见的例子包括含有Asp-Gly的多肽导致形成iso-Asp，多肽中的Cys通过形成二硫键而交联以及Met氧化成亚砜和焦谷氨酸形成。
   
   
4. 非肽杂质 – 有些杂质可能有细胞毒性。如果多肽将用于细胞培养研究，大多数细胞仅能耐受低于1 uM的二硫苏糖醇（DTT）。暴露于一般沉淀过程的低纯度多肽应含有从最终多肽材料中去除的大部分DTT。 RP-HPLC纯化的多肽一般不含DTT。

多肽稳定性

多肽稳定性取决于氨基酸组成和序列。冻干多肽通常比溶液形式更稳定。将多肽以冻干形式保存在-20^oC或-80^oC可最大程度减少降解。应尽量避免暴露于pH>8的环境或接触氧气。以下是多肽的可能降解途径。

1. 水解：含Asp (D)的多肽的常见问题。避免序列含有Asp-Pro (D-P)或Asp-Gly (D-G) 组合，否则这些序列可能会发生脱水，形成环状亚胺中间体。少数情况下，含有Ser (S) 的序列也可能形成可切割肽链的环状亚胺中间体。
   
   
2. 氧化：Cys (C)和Met (M)残基是发生可逆氧化的主要氨基酸。高pH环境可加速半胱氨酸氧化，因为硫醇更易于去质子化并形成链内或链间二硫键。使用二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)处理可逆转二硫键。甲硫氨酸残基可通过化学和光化学途径发生氧化，形成甲硫氨酸亚砜和/或甲硫氨酸砜，这两种途径都很难逆转。
   
   
3. 二酮哌嗪和焦谷氨酸形成：二酮哌嗪形成通常发生在甘氨酸(G)位于N末端第3位点时，Pro (P)或Gly (G)位于第1或第2位点时更易发生。反应涉及到N末端氮对第二和第三氨基酸中间的酰胺羰基的亲核攻击，从而切割前两个氨基酸，形成二酮哌嗪。如果Gln (Q)位于序列的N末端位点，则焦谷氨酸形成几乎是不可避免的。N末端氮攻击Gln (Q)的侧链羰基碳，形成脱氨基焦谷氨酰多肽类似物。这种转变也可能发生在N末端位点含有Asn (N)的多肽序列中，但可能性较小。