感应染料

Monika Baeumle

BioFiles 2011, 6.3, 23.

一氧化氮探针

1998 年，R.F.Furchgott, L.J.Ignarro和F. Murad因发现一氧化氮 (NO) 是心血管系统中的信号分子而获得诺贝尔生理学或医学奖。这彰显了科学界对于一氧化氮作为神经元、内皮细胞和免疫系统信号转运分子的重视程度。NO 与血管舒张¹、神经传递²、细胞毒性、免疫应激³和炎症有关。^4-6

在存在分子氧、四氢生物蝶呤、NADPH 和黄素辅助因子的条件下，一氧化氮合酶 (NOS) 可在细胞内催化精氨酸转化为瓜氨酸和 NO。N^ε-羟基-L-精氨酸是该反应的中间体。NO 的体内半衰期仅为几秒；⁷但这种成分可溶于水性介质和亲脂性介质，因此可轻松透过细胞质和细胞膜扩散。NO 影响着中枢神经系统的神经元传递和突触可塑性。NO 可激活血管系统中的鸟苷酸环化酶，增加 cGMP 合成量，进而诱导平滑肌松弛和血管舒张。NO 的毒性源于其可与超氧阴离子结合形成过氧亚硝酸盐，过氧亚硝酸盐是一种氧化自由基，会损害 DNA 和其他细胞成分。

NO 分子不稳定，在生物系统中的浓度非常低。为实时检测 NO 分子，需要兼具高灵敏度和特异性的方法。如果能找到合适的 NO 探针，荧光显微镜不失为首选方法。这种高时空分辨率技术可对原位 NO 浓度进行可靠成像。

针对灵敏的 NO 探针设计进行深入研究发现，一种涉及邻位芳香族二氨基化合物^8,9的反应可选择性捕获和检测 NO。图 1 以新型 NO 探针 5,6-二氨基荧光素二乙酸酯 (DAF-2-DA) 为例展示了该反应。

图 1. 胞内 NO 测量原理（DAF-2 DA 探针[10]）。亲脂性、不发荧光的 DAF-2-DA 可透过细胞膜，然后被胞质酯酶水解成发弱荧光的 DAF-2 探针。存在 NO 自由基条件下，可转化为发强荧光的三唑荧光素（DAF-2T）。

萘类

2,3-二氨基萘 (DAN) 一度被视作体外和生理条件下测量 NO 浓度的灵敏探针，¹¹在低 nM 浓度范围内，检测到对应的 2,3-萘三唑 (NAT)。但 DAN 上样后会透过细胞膜快速泄漏，经证不适合胞内 NO 检测。 DAN 激发和发射波长极短，在生物基质中也会出现高背景荧光。

因此，业内开发了 DAN-1及其细胞膜透过性前体 DAN-1-EE。¹²DAN-1 由胞质酯酶水解 DAN-1-EE 形成。DAN-1-T（图 2）是 DAN-1 与 NO 的荧光反应产物，泄漏现象表现出明显改善。

图 2. 加入终浓度分别为 5 mM（绿线）或 50 mM（红线）的 NO 成形剂 (NONOate) 后，从 DAN-1 形成发荧光的 DAN-1-T 的时程 [12]。

氧杂蒽

人们开发了基于荧光素和罗丹明的探针，以克服萘类 NO 探针的部分缺点，如细胞毒性、强自发荧光、消光系数小、在中性缓冲液中溶解度差以及激发/发射波长短。^10,13-16

在没有吸附副产物的情况下，DAF-2 对 NO 的体外检测限 (LOD) 为 5 nM。NO 的氧化形式（例如 NO^2-和 NO^3-）及活性氧（例如 O^{2 ·-}、H₂O₂ 和 ONOO^-和 ONOO-）不会与 DAF-2 反应生成荧光产物。因此，在生理条件下，仅在 NO 存在时形成发荧光的 DAF-2 T 。

存在内毒素和细胞因子的情况下使用共焦激光扫描显微镜观察上料 DAF-2-DA 的培养平滑主动脉肌细胞，检测到荧光反应。加入 L-精氨酸会导致荧光信号急剧增加，而补充加入 N-单甲基-L-精氨酸 (L-NMMA) 不会导致信号增加，这清洗证明了 NO-合酶的抑制作用。

荧光素型探针 (DAF-2) 表现出明亮的荧光信号，而罗丹明类探针（DAR-1 和 DAR-2）具有高光稳定性和广泛的 pH 适用范围（表 1、表 2 和图 3）。

表1 DAF 和 DAR 探针的光谱特性a)b)

探针	λab1, max. [nm]		∈ [x10-4 M-1cm-1]		λcm, max. [nm]	相对荧光量子产率
	二氨基	三氮唑	二氨基	三氮唑	三氮唑	二氨基	三氮唑
DAF-2	486	491	7.9	7.3	513	0.005	0.92
DAR-1	550	556	12	8.7	575	0.004	0.25
DAR-2	549	552	10	7.1	571	0.006	0.34

1. 数据来自参考文献。¹¹
2. 20 °C，0.1 M 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 条件下的数据； 通过与罗丹明 B 在乙醇中的已知量子产率进行比较，得出实际荧光量子产率。

表2 DAF 和 DAR 探头的一般特性

	DAF	DAR
λcx [nm]	-490	-550
λcm [nm]	-515（绿光）	-575（红光）
适宜的pH范围	>pH6	>pH4
No检测限	-5 nM（DAF-2，体外）	-10 nM（DAR-M，体外）
光稳定性b	光淬灭70%以上	无光淬灭
细胞核/细胞质占比	均等	细胞质>细胞核

1. 数据来自参考文献。 17^10-12
2. 基于暴露在阳光下 3 小时后的测得荧光强度。

图 3. DAF-2（绿光）、DAR-1（橙光）和 DAR-2（粉光）的荧光强度 (a.u.) 的 pH 依赖性[11]。

氧气探针

氧分子检测在许多应用和生物过程中发挥着重要作用。这类探针是氧敏感指示剂，在与分子氧结合后会改变其荧光强度或最大发射光谱。感应剂可逆且可稳定耐受光淬灭。

ROS探针

活性氧探针 (ROS) 可应用于炎症和癌症等许多疾病研究——这类疾病状态下的细胞产生的 ROS 水平增加。ROS 研究需要具有超低自氧化和低副产物产生率的光稳定传感器。¹⁷

参考文献

1. Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S. 1987. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327(6122):524-526. https://doi.org/10.1038/327524a0

2. Garthwaite J, Charles SL, Chess-Williams R. 1988. Endothelium-derived relaxing factor release on activation of NMDA receptors suggests role as intercellular messenger in the brain. Nature. 336(6197):385-388. https://doi.org/10.1038/336385a0

3. Marletta MA, Yoon PS, Iyengar R, Leaf CD, Wishnok JS. 1988. Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry. 27(24):8706-8711. https://doi.org/10.1021/bi00424a003

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14. Kojima H, Hirotani M, Nakatsubo N, Kikuchi K, Urano Y, Higuchi T, Hirata Y, Nagano T. 2001. Bioimaging of Nitric Oxide with Fluorescent Indicators Based on the Rhodamine Chromophore. Anal. Chem.. 73(9):1967-1973. https://doi.org/10.1021/ac001136i

15. KOJIMA H, SAKURAI K, KIKUCHI K, KAWAHARA S, KIRINO Y, NAGOSHI H, HIRATA Y, NAGANO T. 1998. Development of a Fluorescent Indicator for Nitric Oxide Based on the Fluorescein Chromophore.. Chem. Pharm. Bull.. 46(2):373-375. https://doi.org/10.1248/cpb.46.373

16. Nakatsubo N, Kojima H, Kikuchi K, Nagoshi H, Hirata Y, Maeda D, Imai Y, Irimura T, Nagano T. 1998. Direct evidence of nitric oxide production from bovine aortic endothelial cells using new fluorescence indicators: diaminofluoresceins. 427(2):263-266. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(98)00440-2

17. Xu H, Aylott JW, Kopelman R, Miller TJ, Philbert MA. 2001. A Real-Time Ratiometric Method for the Determination of Molecular Oxygen Inside Living Cells Using Sol?Gel-Based Spherical Optical Nanosensors with Applications to Rat C6 Glioma. Anal. Chem.. 73(17):4124-4133. https://doi.org/10.1021/ac0102718