何为无细胞蛋白质合成？
无细胞蛋白合成或表达是一种合成生物学方法，无需细胞参与即可在溶液中快速生产重组蛋白质。CFPS 利用从一系列不同类型细胞中提取的生物分子翻译机器，让研究人员在一天内表达目标蛋白质。CFPS 是功能性蛋白质体外翻译的理想方法，适用于各种下游应用，是一种可用于各种研究领域的可靠技术。
- 无细胞蛋白质体外翻译采用何种工作原理？
- 制备提取物采用哪些细胞类型？
- CFPS 与其他蛋白质生产方法相比存在哪些优势？
- CFPS存在哪些应用？
- 新一代无细胞蛋白表达试剂盒
- 利用我们的无细胞蛋白表达系统进行的研究文献
- ALiCE® 无细胞蛋白表达试剂盒（植物细胞裂解物）
体外翻译采用何种工作原理？
CFPS 需要编码目标蛋白的 DNA 模板（质粒或 PCR 产物），以及包含驱动转录和翻译所需完整组分的溶液。此溶液为无细胞提取物——之所以这样称呼是因为它仅由细胞质和细胞器材料组成，去除了细胞膜。当遗传物质和无细胞提取物混合时，目标蛋白即可开始表达。
制备提取物采用哪些细胞类型？
早期 CFPS 实验使用源自大肠杆菌的无细胞提取物。大肠杆菌具有快速生长动力学，可快速提供高产量蛋白质，但部分真核蛋白质经证在大肠杆菌 CFPS 后不溶。该领域的技术进步导致可用的细胞类型越来越多，包括，包括小麦胚芽、塔伦托利什曼原虫、兔网织红细胞、昆虫、植物和人类细胞。
每种细胞类型都有其独特的优势。例如，使用小麦胚芽提取物可以翻译大分子蛋白质。此外，小麦胚芽提取物不含与目标蛋白一起翻译的内源 mRNA。小麦胚芽表达的蛋白质源自真核来源，还可保持复杂的 3 维构象。使用植物细胞提取物时，产量可增加至 3mg/mL，且能够实现复杂蛋白质的折叠及其糖基化。
无细胞蛋白质合成与其他蛋白质生产方法相比存在哪些优势？
在活细胞中表达重组蛋白是一种广为人知且使用广泛的蛋白质生产方法。在这种方法中，编码靶蛋白的 DNA 被克隆到表达载体中，随后通过细胞转染、细菌转化或通过病毒转导（利用病毒）将其引入宿主细胞系。该方法的缺点是一些过表达的蛋白质可能具有对宿主有害的活性。此外，CFPE 产品比活细胞生产蛋白质更昂贵。如果需要大量材料或者蛋白表达不佳时，情况尤甚。因此，CFPE 通常用于生成小规模实验用蛋白质，成本高昂。
但由于无需克隆或细胞培养，CFPS 相对于与重组蛋白表达大幅节省了时间。此外，CFPS 更适合高通量应用，且可以提高总体产量。由于无细胞膜，我们还可更轻松地操纵反应条件，包括掺入标记氨基酸。
无细胞蛋白合成应用
CFPS 适用于大量研究，包括：
- 蛋白质-蛋白质或蛋白质-核相互作用鉴定
- 全长、截短或突变蛋白质的结构或功能分析
- 蛋白质折叠、稳定性或降解必需成分鉴定
- 蛋白质微阵列生产
- 病毒样颗粒表达
- 候选药物鉴定
- 核糖体展示
CFPS 有望支持高通量、高性价比地大规模生产研究级蛋白质，应用范围可能会扩大。
新一代无细胞蛋白表达试剂盒
我们的新一代无细胞蛋白表达试剂盒（小麦胚芽）专为克服 CFPE 的成本障碍而开发，同时相对于许多商业化产品，可针对更多靶标蛋白提供卓越的稳定性、更高的产量和更大的灵活性，是一种高成本效益、高 CFPE 产量的解决方案。我们的试剂盒平均产量为 10 µg/反应（每个试剂盒提供 50 个反应），具有许多优势，包括适于高通量蛋白质生产、操作方案用户友好。
我们的试剂盒特别适合生产具有复杂构象和多种蛋白质复合物的蛋白质，例如含有二硫键的蛋白质或完整的膜蛋白，已被研究人员成功用于生产各种蛋白质。
图 1使用 MilliporeSigma 新一代无细胞蛋白表达试剂盒（小麦胚芽）(CFPS700) 轻松放大蛋白质生产。
我们的小麦胚芽提取物中的机器、胶束和细胞器的组合确保即便是膜蛋白也可溶解，无需添加脂质体。此外，使用我们的试剂盒可诱导二硫键，并可选择 N 端或 C 端标签。其他优势包括：
- 可简单线性放大，实现优异的产量：每个试剂盒 5.5mL 样品规模可经济地提供 0.5 - 1 mg 蛋白质
- 经证可表达多种高溶解度蛋白质，包括激酶、酶、转运蛋白、受体、GPCR 蛋白、多聚体蛋白和复合物，以及 10 kDa 到超过 220 kDa 范围的有毒蛋白
- 由于无需克隆和细胞培养且无需密码子优化，即使表达高 A/T 或 G/C 含量的转录本，也可在短短几个小时内快速表达蛋白质
- 开放系统适合向反应混合物中添加天然或非天然成分，是蛋白质标记的理想选择
图 2.对使用新一代无细胞蛋白表达试剂盒（小麦胚芽）（货号CFPS700）产生的多种蛋白质进行蛋白质印迹分析。通过标签抗体（例如抗Flag抗体）检测蛋白质。
利用我们的无细胞蛋白表达系统进行的研究文献
CFPE系统（小麦胚芽）蛋白产量高且易于使用，被选为日本国家先进工业研究所（AIST）“人工蛋白工厂”项目中进行全面蛋白表达研究的最适选择。
在这项发表在《Nature Methods》上的研究中，研究人员尝试表达 13,364 种人类蛋白质，并分为两个功能类别评估它们的生物活性。其中，12996 个克隆 (97.2%) 在 CFPS700 试剂盒中生成了蛋白质，并且发现 75 种测试磷酸酶中 77% 表现出生物活性。
CFPS700 试剂盒包含多项产品改进。例如，添加专利的 3’URT 短翻译增强子 (STE) 使转录的 mRNA 更加稳定，从而提高了蛋白质产量并消除了克隆需要。此外，我们大幅改良的小麦胚芽提取方法提升了提取的裂解物质量和性能稳定性。
为获得高产量研究级重组蛋白，同时维持易用形式和具有竞争力的价格，新一代无细胞蛋白表达试剂盒（小麦胚芽）（货号CFPS700）就是简化研究的最佳选择——无论您的下游应用如何。
ALiCE®无细胞蛋白表达试剂盒（植物细胞裂解物）
ALiCE®试剂盒是一种独特的真核无细胞系统，采用植物细胞的细胞裂解液。与产量通常 0.1 mg/mL 甚至更低的其他真核无细胞系统或产量最高 1 mg/mL 的原核无细胞系统相比，ALiCE®试剂盒在大规模生产模式下实现 了空前的 3 mg/mL 蛋白质产量。ALiCE® 试剂盒的强大之处在于其完整的细胞器，以及源源不断供应能量的活跃线粒体。此外，微粒体（内质网重组为血管）能够实现复杂蛋白质的折叠和翻译后修饰，包括二硫键和糖基化。ALiCE®试剂盒的其他优势包括：
- 以具有市场竞争力的价格提供高达 30 倍的蛋白产量
- 已针对 500 多种蛋白质进行了验证
- 简化的工作流程，可最大限度减少反应启动所需的操作，且随附去垢剂有助于轻松回收蛋白质（包括位于微粒体中的蛋白质）。
图 3.GLuc表达。Gaussia princeps荧光素酶是一种球状蛋白（19 kDa），活性形式包含五个二硫键。蛋白质靶向微粒体，在 25 °C、70% RH、500 rpm 下生产 48 小时以上，并通过 His-Tag 亲和层析纯化。催化腔肠素氧化成腔肠酰胺，通过发光反应 (lambda em) = 475 nm 进行活性测定。纯化过程中荧光素酶浓缩，导致亮度值升高。
ALiCE® 无细胞蛋白表达试剂盒(AL0103000)是一种截然不同的无细胞表达方法和平台。最重要的是，您可将自己现有的无细胞表达工艺轻松升级为 ALiCE® 系统。ALiCE® 无细胞蛋白质表达试剂盒 (AL0103000) 已在 DowDuPont™ 旗下农业生物部门 Corteva Agriscience 以及 Fraunhofer IME 中应用多年，可表达 500 多种不同类型的蛋白质。这意味着 ALiCE® 试剂盒适用于任何目的，包括生物制药、技术酶、作物开发、代谢途径、基础研究等。ALiCE®试剂盒已用于成功表达报告蛋白、抗原、scFv 抗体、 过敏原、激素、全尺寸抗体和膜蛋白。
ALiCE®是 LenioBio GmbH 在德国的注册商标。
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