培养质量在组织培养的各方面都十分重要。所使用材料（细胞系、培养基和其他试剂）的质量将影响培养物的质量以及随后的科学数据和由其衍生的产物。组织培养所关注的主要质量控制方面包括：
- 试剂和材料的质量
- 细胞系的完整性和一致性
- 微生物污染的避免
试剂和材料
试剂和材料是潜在的污染源，特别是牛血清，其已被确定为牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的来源。猪胰蛋白酶也是支原体的潜在来源。许多组织培养基和补充剂制造商都可以提供高质量的试剂和材料。此外，知名的制造商还会进行一系列质量控制测试，包括支原体和BVDV的筛查，并为其产品提供相关分析证书。这些信息可以说明产品和批号，并构成了在细胞储存液生产过程中，试剂记录保存和跟踪的重要组成部分。建议进一步对关键试剂进行测试，例如胎牛血清，以确保即使批次间存在差异也能“适合相关研究目的”。
专为组织培养用途设计的无菌塑料制品（培养瓶、离心管、移液管）的制造商还应为每一批生产的产品提供分析证明，研究人员应保留以供将来参考。
细胞系完整性和一致性
细胞系的来源可能对培养质量产生重要影响。新鲜引入的细胞系是主要的污染源。从公认的来源（例如ECACC培养物集合）获得细胞系的优势在于培养物将是：
- 不含污染物的
- 已对人类细胞系使用短串联重复序列分析进行鉴定，并通过DNA条形码对其他物种进行鉴定来确定其起源物种
- 随附详细的数据表
一旦从公认的来源获得了细胞系，实施主细胞库和工作细胞库程序以及相关的质量控制步骤十分重要，例如微生物污染物的常规测试和培养物身份确认。
微生物污染的避免
潜在的污染源包括其他细胞系、实验室条件以及在核心领域（例如无菌技术和良好的实验室操作规范）缺乏良好培训的人员。因此，仅使用已知来源和质量的细胞和试剂不足以保证产品（细胞储备液或培养物）的质量。必须在整个生产过程中以及最终产品中对质量进行确认。常规筛查有助于及早发现污染，因为所有操作都是潜在的污染源。
组织培养中的三种主要微生物污染物类型是：
- 细菌和真菌
- 支原体
- 病毒
细菌和真菌污染
细菌污染通常是肉眼可见的，并可通过pH变化所导致的培养基浊度突然增加和颜色变化来进行检测。细胞培养物可能存活很短一段时间，但细胞最终必然死亡。每天对培养物进行显微镜观察可确保及早发现污染，并在污染的最初迹象明显时能够采取适当的措施。另外，细菌和真菌的特定检测应作为常规和定期质量控制筛选程序的一部分。
支原体污染
支原体是最小的无需宿主且自我复制的原核生物。它们缺乏细胞壁和合成细胞壁的能力。它们的直径为0.3μm，可以以丝状或球状形式观察到。其中主要有6种物种是组织培养污染物，分别是猪鼻支原体、精氨酸支原体、口枝原体、发酵支原体、人支原体和莱氏衣原体。
支原体感染的影响比细菌和真菌的影响更大，在细胞培养中会引起多种长期影响。这些可以包括：
- 生长率变化
- 形态变化
- 染色体畸变
- 氨基酸和核酸代谢的改变
然而，尽管这些影响有充分的文献记载，但支原体的存在常常没有得到测试，结果在这些实验室中大多数细胞系支原体为阳性。支原体污染难以检测，需要使用专业技术。在过去，只有专业实验室（例如培养物收集站）进行了这些测试。然而，尽管试剂盒的性能特征差异很大，但是现在可以使用多种商业支原体检测试剂盒进行检测。这些检测的组合应该用作常规和常规质量控制筛选程序的一部分。ECACC会常规检测培养物中是否存在支原体，并提供支原体检测服务。
病毒污染
一些细胞系包含内源性病毒并在表面上分泌病毒颗粒或表达病毒抗原，例如Epstein-Barr病毒（EBV）转化的细胞系。这些细胞系不被视为污染。然而，牛血清是牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染的潜在来源，使用受感染的血清会产生病毒感染的细胞系。BVDV对细胞系的污染可能会导致生长速度发生轻微变化，但是由于该病毒是非细胞致病性的，因此无法检测到培养物中的宏观和微观变化。牛血清供应商知道这一点并会进行相应地血清筛查。通常，血清以经BVDV测试的形式出售。尽管如此，您仍应该始终仔细检查以确保您了解在血清中进行的任何测试的结果。血清是否显示为经BVDV测试且未检出？检测的灵敏度是多少？经BVDV测试的血清不一定不含BVDV。
如果细胞培养物被污染该怎么办
组织培养中一个被严重低估的问题是常规使用抗生素。连续使用抗生素是不必要的，并且可能导致难以消除的耐药菌株的产生，并可能导致需要使用可能对细胞培养物有毒的更多外源性抗生素。另外，抗生素的使用可能掩盖掉低水平的污染。
一旦检测到污染，无论是由于细菌、真菌还是支原体引起的，建议的处理措施是丢弃培养物，并继续使用已知不含污染物的较早种群或从认可的种群中获取新鲜种群资源。
由于病毒感染对抗生素处理无反应，因此几乎不可能从培养物中去除病毒感染。而且，由于它们是细胞内的寄生虫，因此不可能通过离心或其他分离技术将其除去。如果没有可用的无病毒储存液或无病毒替代品，则在继续使用受感染细胞系之前应进行彻底的风险评估。
环境监测
好的做法是对制备细胞培养物及其产物的实验室环境进行监测。装有HEPA过滤器的2级微生物安全柜应每6个月进行测试以确保其有效运行，即对通过过滤器的气流水平进行测试。但是，也建议通过定期将敞开的沉降板（Tryptone Soya Bean Agar细菌培养板）放置在柜子的工作表面上来监控污染物进入柜子的水平。此外，应使用沉降板对实验室周围选定点的空气中微生物负荷进行评估。培养板应保持打开状态4小时。此后，应将其盖好，放在密闭盒中，并在32°C和22°C下孵育最多7天。在此阶段结束时，应检查平板是否存在微生物生长。应记录柜中每个板的位置，并存储结果以进行趋势分析。
可接受的限值应按照“警报”级别和“行动”级别来定义，实际值取决于工作区域的密闭等级、工作的关键程度以及在正常操作条件下可达到的清洁度。
无菌技术和污染控制
个人卫生
进入实验室时，重要的是要洗手，因为这会去除皮肤干燥和粘附的微生物，这些微生物可能会污染细胞培养物。必须穿外罩服和佩戴一次性手套。应当经常用70％（v/v）无菌酒精擦拭手套。其他个人防护设备包括头罩和面罩，但并非总是必需的，尤其是在使用2级微生物安全柜时。应将长发扎紧，以防止阻碍并减少污染的风险。
在微生物安全柜内工作
在安全柜内操作时，操作员应记住，气流不会使环境无菌，但可以保持环境清洁。在进行任何实际操作之前，应将实验所需的所有材料存放到安全柜中。在这种情况下，操作员可限制将手/臂从安全柜移入非清洁环境的次数。在安全柜中摆放时，必须保持无杂物状态。安全柜中的每个物品都应放置在适当的位置，以最大程度地减少执行细胞培养操作的区域内的移动和递送。安全柜的前部和后部均应清洁，以实现最大气流。培养瓶和培养皿应该是最后进入安全柜的物品。所有进入安全柜的物品都必须喷洒70％（v/v）的无菌酒精，以防止灰尘和微粒进入安全柜。
移液和气溶胶的预防
一次性塑料移液器（1mL、2mL、5mL、10mL和25mL）是细胞培养中最易用的形式。移液错误（例如物料溢出）会引起微生物和细胞污染。遵守以下指导可最大限度地减少与移液相关的污染和安全风险。
- 绝不可用嘴移液
- 使用自动移液器辅助，每个安全柜都应指定一个移液器辅助工具。确保移液器完全插入移液器辅助装置中。为避免污染，请定期对移液器进行消毒，并确保定期更换过滤器
- 转移培养基时请使用带塞的移液器
- 避免将液体吸入移液器塞。仅单次使用移液器
- 为避免产生气溶胶请勿在培养基或移液器中产生气泡。气溶胶可以传播污染性微生物，并且通过将细胞引入空气中会增加交叉污染的潜在风险
- 立即用70％（v/v）无菌酒精清洁溢出的液体
如要继续阅读，请登录或创建帐户。
暂无帐户？