Duolink^® ;PLA故障排除指南

该指南描述了如何使用Duolink^® In Situ Probemaker将PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）与任何用于Duolink^® PLA实验的抗体进行偶联。只要是使用了PLUS PLA探针和MINUS PLA探针，Probemaker生成的PLA抗体便可与标准的Duolink^® PLA探针组合或独立使用。如需了解更多关于Probemaker应用的信息，请访问Duolink^® PLA故障排除指南中“创建您自己的PLA^® 探针和Duolink^® Probemaker”章节。

如想了解Duolink^® PLA技术，请下载我们的手册并查阅如何优化Duolink^®邻位连接测定获得更多详细信息。可在Duolink^®资源中心获取Duolink^® PLA实验方案以及使用Probemarker生成的PLA抗体所需的其他Duolink^® PLA试剂的相关信息。

应用
材料和设备
Duolink^® PLA Probemaker偶联实验方案
Duolink^® PLA检测实验方案
故障排除

应用

当单独使用当前的Duolink^® PLA探针不可行或不理想时，可使用Duolink^® Probemaker。本节介绍Duolink^® Probemaker的常见应用。

1.使用来自相同物种的一抗

当使用来自相同物种的两种一抗时，Duolink^® Probemaker可用于将PLA PLUS寡核苷酸与其中一种抗体偶联，而另一种则用PLA MINUS寡核苷酸进行偶联。当仅使用直接偶联的一抗时，则无需二抗或Duolink^® PLA探针，且应跳过PLA实验方案中的这一步。

2.使用来自任何物种的一抗

当前提供的Duolink^® PLA探针是与PLA偶联的二抗，可识别来自小鼠、兔或山羊的IgG。当使用源自小鼠、兔或山羊以外物种的两种一抗时，Duolink^® Probemaker可用于用PLA寡核苷酸标记一抗或适当的二抗。将其中一种抗体与PLA PLUS寡核苷酸偶联，将另一种抗体与PLA MINUS寡核苷酸偶联。

当仅有一种一抗是源于小鼠、兔或山羊以外的物种时，只要是使用了PLUS PLA探针和MINUS PLA探针，便可使用Duolink^® Probemaker生成的PLA抗体和标准Duolink® PLA探针的组合。

3.使用源自与组织样品相同宿主物种的一抗（如“小鼠用于小鼠”）

使用源自小鼠的一抗对小鼠组织进行染色通常会导致高背景，这是由于二抗会与待染色组织中的内源性小鼠IgG以及B细胞、浆细胞和巨噬细胞上的Fc受体结合而引起的。为了绕过抗小鼠二抗的使用并降低背景，可使用Duolink^® Probemaker将源自小鼠的一抗与PLA寡核苷酸直接偶联。

材料和设备

Duolink^® Probemaker试剂

有关具体的产品建议，请参阅Duolink^® PLA产品选择指南。Duolink^® Probemaker支持创建定制化的PLA寡核苷酸偶联抗体，只要是使用了PLUS PLA和MINUS PLA探针，其便可与标准的Duolink^® PLA探针组合或独立使用。每款Duolink^® PLA Probemaker试剂盒都含有可偶联20 µg浓度为1 mg/mL的抗体的试剂。这些试剂包括：

1. Duolink^® PLA寡核苷酸 – 一管含有冻干、活化的寡核苷酸（PLUS或MINUS）
2. 偶联缓冲液 – 用于缓冲偶联反应
3. 终止试剂 – 用于终止偶联反应
4. 储存溶液 – 用于保存偶联后的抗体（PLA探针）
5. 20x 检定试剂 – 在必要时可加入至实验者优化的抗体稀释液
6. 封闭溶液 – 用于在一抗孵育前封闭样品
7. PLA探针稀释液 – 用于将偶联后的抗体（PLA探针）稀释至最终测定浓度

说明：在-20 °C下保存所有的试剂。抗体偶联后，保存在4 °C下。

其他材料

1. 一抗或二抗 – 用于与PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）偶联。抗体需满足以下标准才可用于偶联：

   1. 待偶联的抗体必须具有1 mg/mL的浓度。单次偶联所需的抗体量为20 µg（=20 µL）。

      说明：如果使用的是单克隆抗体，则该抗体应由Protein A或Protein G亲和纯化。

   2. 抗体必须在无胺缓冲液中（最好是PBS）。缓冲液应是无载体且无保存剂的，但可含有不超过0.1％的BSA、5％的海藻糖和0.02％的叠氮化钠。

      说明：如果不知道保存抗体的缓冲液的组成，建议在偶联前进行透析或更换缓冲液。

      说明：不建议在Duolink^® In Situ Probemaker偶联之前对极稀的抗体进行浓缩，除非有很大的量，因为滤器型浓缩器会造成很大的损失。

2. 1 x PBS – 可在必要时用于抗体的缓冲液交换。建议的缓冲液交换过程如下：

   说明：该过程不适用于还原高浓度的BSA或其他大分子。

   1. 首先用1 x PBS通过3000 rpm离心1 min而对离心柱进行预平衡，然后加入400 µL 1x PBS并再次离心1 min，重复4次。将离心柱放置到一个新的离心管中。

   2. 向柱中加入抗体（12–50 µL）并再次3000 rpm离心2 min。所收集抗体的浓度应通过OD进行验证。1 mg/mL应具有1.4的OD 280 nm。

   注意：可以使用Microcon-10离心式滤器单元（产品编号MRCPRT010）。

Duolink^® PLA Probemaker偶联实验方案

该偶联实验方案描述了如何将PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）与任何抗体偶联。开始之前，确保待偶联抗体在无胺缓冲液中的浓度为1 mg/mL。该抗体缓冲液应是无载体且无保护剂的，但可含有不超过0.1％的BSA、5％的海藻糖和0.02％的叠氮化钠。在使用前将所有的液体试剂进行涡旋。

1. 将2 µL偶联缓冲液加入至20 µL的待偶联抗体中。抗体浓度应为1 mg/mL。
2. 缓慢吹打混匀。
3. 将抗体溶液转移至一管冻干的寡核苷酸（PLUS或MINUS）中。
   说明：在打开冻干寡核苷酸的小管后立即加入抗体溶液。
4. 缓慢吹打混匀。
5. 室温孵育过夜。
6. 向反应中加入2 µL终止试剂。
7. 室温孵育30分钟。
8. 加入24 µL储存溶液，以及其他必要的试剂来稳定特定的抗体。
   
9. 在稳定完成后，PLA探针可4 °C保存在储存溶液中。

Duolink^® PLA检测实验方案

只要是使用了PLUS PLA和MINUS PLA偶联的抗体，Duolink^® PLA荧光实验方案或Duolink® PLA明场实验方案便可使用与Duolink® PLA探针组合或独立使用的Probemarker生成的抗体。请注意以下更改可能会影响到基于您PLA探针的实验：

1. 应使用Probemarker试剂盒中的PLA探针稀释液取代荧光和明场实验方案中的Duolink^®抗体稀释液。

2. 可选：当使用定制抗体稀释液而非提供的PLA探针稀释液时，建议在使用PLA偶联抗体前用您的定制抗体稀释液按1:20将20x 检定试剂进行稀释。

3. 在荧光和明场实验方案中相应的正确步骤进行PLA偶联抗体的孵育。如果采用一抗进行偶联，则在一抗孵育步骤（荧光第2步；明场第3步）使用它们。如果采用二抗进行偶联，则在PLA探针孵育步骤（荧光第3步；明场第4步）使用它们。

4. 当仅使用直接偶联的一抗时，无需二抗或Duolink^® PLA探针。因此，可跳过荧光和明场实验方案中的PLA探针孵育步骤（分别是第3步和第4步）。对于任何其他的PLA探针组合，实验方案都应按此进行。

疑难解答

请参阅Duolink^® PLA故障排除指南查找故障排除的提示和技巧、一般故障排除说明、以及常见问题解答。

请随时联系我们的技术支持团队或当地销售代表以获得实验方面的帮助。

定制服务

您的实验是否需要额外的定制？让我们为您完成这项工作。请详细了解我们的定制服务计划，以加速您的Duolink^® PLA项目。

参考文献

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473