Duolink® PLA多色检测方案
本方案描述了如何使用Duolink® PLA多色试剂同时检测、可视化和定量一个组织或细胞样本中多达4种的蛋白、蛋白修饰或蛋白互作。
材料与设备
Duolink® PLA试剂
Duolink® PLA多色检测实验需要以下Duolink® PLA多色产品：
- 2至4种Duolink® PLA多色探针制备试剂盒（可选红色、绿色、橙色和/或远红）试剂盒包含：
- Duolink® PLA多色寡核苷酸 2管冻干的活化寡核苷酸（用于偶联一抗）。
红色寡核苷酸A 与 红色寡核苷酸B，
绿色寡核苷酸C 与 绿色寡核苷酸D，
橙色寡核苷酸F 与 橙色寡核苷酸G， 或
远红寡核苷酸H 与 远红寡核苷酸I - 偶联缓冲液 – 用于缓冲偶联反应
- 终止剂 - 用于终止偶联反应
- 储存液 - 用于保存寡核苷酸偶联抗体（PLA探针）
注意：-20 °C保存所有试剂。特定的寡核苷酸对与一抗偶联的详细方法请参阅Duolink® PLA多色检测探针制备指南。抗体偶联后，将制备好的PLA探针保存在+2-8°C下。切勿冻存。
- Duolink® PLA多色寡核苷酸 2管冻干的活化寡核苷酸（用于偶联一抗）。
- Duolink® PLA多色试剂套装。试剂盒包含：
- 连接原液(5X) – 稀释配制1X连接缓冲液
- 连接酶(1 U/μL) – 用于配制连接液
- 扩增原液(5X) – 稀释配制1X扩增缓冲液
- 聚合酶 (10 U/μL) - 用于配制扩增液
- 封闭液 – 用于在孵育抗体前封闭样品
- Probemaker PLA探针稀释剂– 用于稀释定制PLA探针
- 检测原液(5X) – 稀释配制1X检测缓冲液
注意：收到后，可将1X封闭液和1X Probemaker PLA探针稀释剂储存在2-8°C下。其他所有组分-20 °C储存。
- 荧光用洗涤缓冲液 （A和B）
- 含DAPI的Duolink®封片剂（用于载玻片，储存在+2-8°C）或者细胞核染色剂和抗淬灭剂（用于微孔板，储存在-20°C）
自备材料
- 检测目标蛋白质的一抗。
- 超纯水（无菌过滤，Milli-Q®或类似水质）
- 载玻片样本（细胞或组织），已经过固定、修复和透化方面的预处理
设备
- 荧光显微镜，带有适当的滤光片、照相机和图像采集软件
- 37°C培养箱
- 水平摇床
- 温湿度箱或微孔板传热块
- 疏水笔，用于给反应区域划界
- 冰块（用于酶）
- 染色罐
- 镊子
- 移液器和吸头（1 μl至1000 μl）
- 盖玻片，适用荧光显微镜
DUOLINK® PLA多色检测方案
以下实验方案适用于1 cm2的载玻片样品，需要40 µL溶液充分覆盖。
可根据反应面积和样品数量调整溶液体积。所有孵育均应在湿度箱中进行。所有洗涤步骤均应在室温下使用至少70 ml洗涤缓冲液在染色罐中温和搅拌进行。
试剂准备
洗涤缓冲液A和B应在开始检测之前配制，将一袋溶解在高纯度纯水中，定容至1,000 mL。溶液短期（短于两周）室温存放，长期则+2-8 °C储存。
注意：使用前将溶液升温至室温。
- 0.01X洗涤缓冲液B应在开始检测之前用超纯水1:100稀释1X洗涤缓冲液B配制。
- 许多Duolink® PLA试剂以浓缩原液形式提供，应在临用前稀释。请勿储存稀释后的Duolink® PLA试剂。
Duolink® PLA多色实验方案
在开始之前，将样品沉积在载玻片上，并经过固定、恢复和/或透化方面的预处理。
- 封闭
注意：使用前拧紧1X封闭液的盖子，因为冻融过程中滴瓶盖可能会松脱。+2-8°C储存。- 每1 cm2样本滴加1滴(~40 µL)Duolink®封闭液。务必保证用封闭液完全盖住整个样本。
- 在温湿度箱中37°C孵育载玻片60分钟。
- 一抗孵育
注意：在添加抗体之前请勿让载玻片干燥，否则会导致背景。- 用Probemaker PLA探针稀释剂一起稀释所有寡核苷酸偶联一抗。按照在单色Duolink® PLA检测中发挥最佳抗体性能的浓度稀释。
- 拍掉玻片上的封闭液。
- 每个样本加入一抗溶液。
- 在湿度箱中孵育玻片。采用适合所有一抗的最佳孵育温度和时间。
- 连接
注意：连接酶要等到需要添加到样品中时再添加。确保连接缓冲液在使用前完全解冻。- 拍掉玻片上的一抗液体。
- 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
- 在洗涤过程中，配制连接液。涡旋混匀5x多色PLA连接缓冲液。
- 超纯水1:5稀释5x多色PLA连接缓冲液并混匀。对于40 µL反应，将8 µL 5x连接缓冲液加到30 µL超纯水中（减去连接酶体积）。为所有样品制备足量的溶液。
- 使用冰块恢复从冰箱里取出的连接酶(-20 °C)。
- 用1x连接缓冲液1:20稀释连接酶并混匀。对于40 µL连接液，将2 µL连接酶加到38 µL 1x连接缓冲液中。
- 拍掉多余的洗涤缓冲液，加入连接液。
- 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片30分钟。
- 扩增
注意：聚合酶要等到需要添加到样品中时立即添加。- 拍掉玻片上的连接液。
- 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
- 在洗涤过程中，配制扩增液。涡旋混匀5x扩增缓冲液。
- 用超纯水1:5稀释5x扩增缓冲液并混匀。对于40 µL反应，将8 µL 5x扩增缓冲液加到31 µL超纯水中（减去聚合酶体积）。为所有样品制备足量的溶液。
- 使用冰块恢复从冰箱里取出的聚合酶(-20°C)。
- 用1x扩增缓冲液1:40稀释聚合酶并混匀。对于40 µL反应，将1 µL聚合酶加到39 µL 1x扩增缓冲液中。
- 拍掉多余的洗涤缓冲液，加入扩增液。
- 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片100分钟。
- 检测
注意：多色PLA检测缓冲液对光敏感。需避光使用所有含缓冲液的溶液。- 拍掉玻片上的扩增液。
- 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
- 在洗涤过程中，配制检测液。涡旋混匀5x多色PLA检测缓冲液。
- 用超纯水1:5稀释5x多色PLA检测缓冲液并混匀。对于40 µL反应，将8 µL 5x检测缓冲液加到32 µL超纯水中。为所有样品制备足量的溶液。
- 拍掉多余的洗涤缓冲液，加入检测液。
- 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片30分钟。
- 最终洗涤
注意：试剂对光敏感。全程避光保护玻片。- 拍掉玻片上的检测液
- 用1x洗涤缓冲液B室温洗涤玻片2x 10分钟
- 用0.01X 洗涤缓冲液B洗涤玻片1分钟
- 成像准备
注意：Duolink®原位封片剂（含DAPI）是液态的，不会固化。可用干净的指甲油密封盖玻片和载玻片的边缘。避免在盖玻片下制造气泡。- 拍掉载玻片上多余的洗涤缓冲液。
- 用尽可能少的Duolink® PLA封片剂（含DAPI）封住载玻片和盖玻片。
- 静置15分钟后使用20倍物镜，在荧光或共聚焦显微镜中分析。
结果
图像采集
使用荧光显微镜，并根据检测荧光染料选用合适的滤光片，检查Duolink® PLA多色实验结果。Duolink® PLA信号表现为散落在细胞各个部位的荧光点（图1A）。每个信号为亚微米大小，可能处在多个焦平面上。因此，需要扫遍整个样本厚度来获得图像。注意，当进行直接检测的Duolink® PLA时（即剔除寡核苷酸偶联一抗时），不应检测到PLA信号。如有可能，应设置生物学对照（图1B）。
图 1.用EGF刺激SK-OV3细胞(A)，或不做刺激作为生物学对照(B)。不同颜色分别代表Duolink® PLA多色检测的EGFR-HER2相互作用（绿色）、EGFR磷酸化（橙色）和HER2磷酸化（远红）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。
根据信号强度的不同，每种荧光染料的采集参数（曝光时间、增益等）也会不同。但切记在单次实验中，对所有样本都要采取针对每种荧光染料优化的相同的图像捕获参数。使用阳性和阴性对照可优化参数设置。当PLA信号数较多时，PLA信号会合并/重叠（图2）。这种情况在研究高表达蛋白或图像捕获过曝时都会发生。因此需要小心设置采集参数并采用合适的一抗滴度，以获得分散的PLA信号。
图 2.Duolink® PLA多色检测未刺激SK-OV3细胞中的EGFR（绿色）、HER2（橙色）和GAPDH（红色）。细胞核用DAPI染色（蓝色）。
PLA信号可通过多种图像分析工具定量。使用图像数据可分析PLA信号的平均荧光强度和/或每个细胞或细胞每个区域的PLA信号总数（图3）。定量结果表示为相对同一实验中技术和/或生物学对照的数值。不过只有当PLA信号没有重叠且像素未饱和时，才有可能进行可靠定量。
图 3.使用成像软件进行图像分析。DAPI染色核（蓝色）自动检测，细胞质大小由用户推算（绿线区域）。PLA信号（红色）代表目标蛋白。分析时，对白点标记的PLA信号和黄线框选的细胞核进行定量。
参考文献
多重 PLA 论文
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