磷酸钙转染试剂盒实验方案

简介

磷酸钙转染是将DNA导入真核细胞的常用方法。该技术已在多种细胞类型中获得了瞬时¹并且稳定²的转染。该方法是基于将含有磷酸钠的HEPES缓冲盐水和含有DNA的CaCl₂溶液进行缓慢混合实现的。所形成的DNA-磷酸钙共沉淀物可粘附于细胞表面，并可能通过胞吞作用被细胞吸收。甘油休克可以增加某些细胞类型的DNA摄取。

提供的试剂

磷酸钙转染试剂盒（货号CAPHOS）中提供的试剂是经0.2 µM滤器无菌过滤并灌装的。该试剂盒可供：

• 在10厘米的培养皿上进行80次转染
• 或者在6厘米的培养皿上进行160次转染（约25×6孔板）
• 或者在3.5厘米的培养皿上进行400次转染（约36×12孔板）

磷酸钙转染试剂盒（货号CAPHOS）中包含：

• 1瓶2.5M CaCl₂（货号C2052）
• 1瓶（25 mL）分子生物级水（货号W4502）
• 1瓶（25 mL）2x HEPES缓冲盐水，pH 7.05（货号H1012)
  50 mM HEPES，280 mM NaCl，1.5 mM Na₂HPO₄

储存

在-20 °C储存所有组分。
在使用前将所有试剂盒组分解冻并平衡至室温。

操作流程

下述方法适用于用将1 μg/μL pSV40-CAT质粒（在无菌分子生物级水中稀释）转染至CHO细胞。在适合细胞类型的标准含血清或无血清培养基中进行细胞培养。该过程不推荐使用抗生素。应使用良好的无菌技术，并且仅使用无菌材料进行操作。

DNA质粒应该是高质量的，经乙醇沉淀，并重悬于分子生物级水中，终浓度为1 μg/μL。

该实验步骤可经优化用于各种细胞类型。其中接种密度、使用的DNA量、孵育时间以及甘油休克，均可在需要时进行修改以实现更高的表达和更低的毒性。

第一天：接种细胞 按照下表进行细胞接种：

培养皿	细胞接种密度
3.5厘米培养皿	2 x 105
6厘米培养皿	5 x 105
10厘米培养皿	1 – 2 x 106

第二天：转染

1. 请根据下表添加新鲜的完整培养基，以进行细胞转染准备：

培养皿	加入新鲜的完全培养基（mL）
3.5厘米培养皿	1
6厘米培养皿	2
10厘米培养皿	4

2.两小时后，按下述操作在两个试管中制备转染试剂：

培养皿	管A（轻轻混合）			管B
		CaCl2 (µL)	H2O (µL)	DNA (µL)	HeBS (µL)
3.5厘米培养皿	6	49	5	60
6厘米培养皿	15	123	12	150
10厘米培养皿	30	245	25	300

3.将移液器泵连接至装有200uL移液头的1mL血清移液管上，并使用该自动移液器泵对HeBS（管B）鼓泡。

4.在鼓泡HeBS（管B）的同时，逐滴添加管A（来自步骤2）的内容物。

5.涡旋2 - 4秒。

6.随后，让沉淀物静置20分钟。

7.将溶液均匀地滴在孔板中的细胞培养基上。轻轻搅动培养皿，使沉淀物均匀分布在培养皿中的细胞上。

8.将细胞孵育过夜（约16小时）。

第三天：甘油休克（可选）

1. 将以下物质在离心管中混合：

培养皿	50％无菌甘油（µL）	2x HeBS (µL)	H2O (µL)
3.5厘米培养皿	100	250	150
6厘米培养皿	225	565	335
10厘米培养皿	450	1130	670

2.从培养皿中取出培养基并更换甘油溶液。孵育2分钟。

3.移除甘油溶液，并用PBS洗涤两次：

培养皿	每次洗涤所用PBS体积（mL）
3.5厘米培养皿	2
6厘米培养皿	5
10厘米培养皿	10

第三天：更换培养基

1. 在过夜孵育（或选择甘油休克）后，吸出培养基（或PBS）并用完全培养基进行替换。
2. 将细胞孵育48小时。
3. 收集并裂解细胞 - 它们已可用于其他应用。

参考文献

1. Graham F, van der Eb A. 1973. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52(2):456-467. https://doi.org/10.1016/0042-6822(73)90341-3

2. Wigler M, Pellicer A, Silverstein S, Axel R. 1978. Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell. 14(3):725-731. https://doi.org/10.1016/0092-8674(78)90254-4