17-10219

LentiBrite GFP-Cortactin Biosensor Lentiwirusowy

• UNSPSC Code: 41106621
• NACRES: NA.32
• eCl@ss: 34360190
• Technique(s): cell migration: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, transfection: suitable

Właściwości

• Quality Segment: 300
• purified by: (PEG precipitation)
• technique(s): cell migration: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunofluorescence: suitable, transfection: suitable
• UniProt accession no.: Q14247
• detection method: fluorometric

Opis

General description

Kortaktyna jest kluczowym mediatorem migracji i inwazji komórek, który lokalizuje się w bogatych w aktynę strukturach lamellipodii, inwadopodii i podosomów, gdzie promuje tworzenie i utrzymuje stabilność rozgałęzionych sieci aktynowych. Ze względu na swoją wielodomenową strukturę, kortaktyna oddziałuje również z różnorodnymi regulatorami cytoszkieletu i białkami sygnalizacyjnymi. Białka fluorescencyjne połączone z kortaktyną zostały wykorzystane w żywych komórkach do monitorowania dynamiki tworzenia inwadopodii.
Cząsteczki lentiwirusowe LentiBrite GFP-cortactin firmy EMD Millipore zapewniają jasną fluorescencję i precyzyjną lokalizację, umożliwiając analizę inwadopodii i lamellipodii w żywych komórkach w trudnych do transfekcji typach komórek.

Application

Obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej:
Komórki czerniaka ludzkiej skóry RPMI-7951 umieszczono na szkiełku komorowym pokrytym żelatyną i transdukowano cząstkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny. Po wymianie pożywki i 24 godzinach dalszej inkubacji, komórki utrwalono formaldehydem i zamontowano. Obrazy uzyskano za pomocą zanurzeniowej mikroskopii fluorescencyjnej szerokiego pola. GFP-kortaktyna lokalizuje się najwyraźniej w wypukłościach na obrzeżach komórek, odpowiadających lamellipodiom.

Porównanie immunocytochemiczne:
Komórki ludzkiego gruczolakoraka piersi, MDA-MB-231, umieszczono na szkiełku komorowym pokrytym żelatyną i transdukowano cząsteczkami lentiwirusowymi w MOI 10 przez 24 godziny. Po 24 godzinach wymieniono pożywkę, a komórki poddano dalszej inkubacji przez 24 godziny. Podobne wzorce ekspresji obserwuje się dla GFP-kortaktyny i barwienia immunocytochemicznego przeciwciałem monoklonalnym przeciwko kortaktynie sprzężonym z Alexa Fluor 555 (EMD Millipore nr kat. 16-229).

Różne typy komórek inwazyjnych:
Komórki mysich makrofagów otrzewnowych, IC21 lub komórki nieinwazyjnego czerniaka ludzkiej skóry, SK-MEL-28, umieszczono na szkiełkach komorowych pokrytych żelatyną i transdukowano cząstkami lentiwirusowymi w MOI 20 przez 24 godziny.

Różne typy komórek wykazują różny zakres wzorów degeneracji, które mogą być obserwowane z powodu tworzenia inwadopodii lub podosomów. Zlokalizowane obszary koncentracji GFP-kortaktyny zaobserwowano w komórkach IC21, podczas gdy nieinwazyjne komórki czerniaka SK-MEL-28 wykazywały słabszą i rozproszoną ekspresję kortaktyny.

Aby uzyskać optymalną wizualizację fluorescencji, zaleca się analizę docelowego poziomu ekspresji w ciągu 24-48 godzin po transfekcji/infekcji w celu optymalnej analizy żywych komórek, ponieważ intensywność fluorescencji może z czasem słabnąć, szczególnie w trudnych do transfekcji liniach komórkowych. Zainfekowane komórki można zamrozić po udanej transfekcji/infekcji i rozmrozić w hodowli, aby zachować dodatnią ekspresję fluorescencyjną przez ponad 24-48 godzin. Długość i intensywność ekspresji fluorescencyjnej różni się w zależności od linii komórkowej. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być wymagane wyższe MOI.

Preparation Note

Przechowywanie i obsługaLentiwirus jest stabilny przez co najmniej 4 miesiące od daty otrzymania, gdy jest przechowywany w temperaturze -80°C. Po pierwszym rozmrożeniu natychmiast umieścić na lodzie i zamrozić w podwielokrotnościach roboczych w temperaturze -80°C. Zamrożone podwielokrotności mogą być przechowywane przez co najmniej 2 miesiące. Dalsze zamrażanie/rozmrażanie może spowodować zmniejszenie miana wirusa i wydajności transdukcji. WAŻNE INFORMACJE DOTYCZĄCE BEZPIECZEŃSTWA Wektory lentiwirusowe z defektem replikacji, takie jak wektor 3. generacji dostarczony w tym produkcie, nie powodują żadnych chorób u ludzi ani zwierząt. Jednakże, lentiwirusy mogą integrować się z genomem komórki gospodarza i tym samym stwarzać pewne ryzyko mutagenezy insercyjnej. Materiał należy do grupy ryzyka 2 i powinien być obsługiwany pod kontrolą BSL2. Szczegółowe omówienie bezpieczeństwa biologicznego wektorów lentiwirusowych znajduje się w Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-ART^® lentiviral vectors for research use: Ocena ryzyka i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa biologicznego. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.

Analysis Note

Evaluated by transduction of HT-1080 cells. Fluorescent imaging performed for assessment of target localization and transduction efficiency.

Other Notes

TagGFP2-Cortactin Lentivirus: One vial containing 25 µL of lentiviral particles at a minimum of 3 x 10E8 infectious units (IFU) per mL. For lot-specific titer information, please see “Viral Titer” in the datasheet. Promoter EF-1 (Elongation Factor-1) Multiplicty of Infection (MOI) MOI = Ratio of # of infectious lentiviral particles (IFU) to # of cells being infected. Typical MOI values for high transduction efficiency and signal intensity are in the range of 20-40. For this target, some cell types may require lower MOIs (e.g., HT-1080, HeLa, U2OS, human mesenchymal stem cells (HuMSC)), while others may require higher MOIs (e.g., human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)). NOTE: MOI should be titrated and optimized by the end user for each cell type and lentiviral target to achieve desired transduction efficiency and signal intensity.

Legal Information

ART is a registered trademark of Molecular BioProducts, Inc.

Disclaimer

Ten produkt zawiera organizmy zmodyfikowane genetycznie (GMO). W UE GMO są regulowane odpowiednio dyrektywami 2001/18/WE i 2009/41/WE Parlamentu Europejskiego i Rady oraz ich krajową implementacją w państwach członkowskich. Przepisy te zobowiązują {HCompany} do żądania pewnych informacji o użytkowniku i zakładzie, w którym przetwarzane są GMO. Kliknij tutaj, aby wyświetlić formularz deklaracji użytkownika końcowego (EUD).O ile nie określono inaczej w naszym katalogu lub innej dokumentacji firmy dołączonej do produktu(ów), nasze produkty są przeznaczone wyłącznie do użytku badawczego i nie mogą być wykorzystywane do żadnych innych celów, w tym między innymi do nieautoryzowanych zastosowań komercyjnych, zastosowań diagnostycznych in vitro, zastosowań terapeutycznych ex vivo lub in vivo ani do żadnego rodzaju konsumpcji lub stosowania u ludzi lub zwierząt.

Ta strona może zawierać tekst przetłumaczony maszynowo.

Informacja o środkach bezpieczeństwa

• Klasa składowania: 10 - Combustible liquids
• wgk: WGK 2