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  • Advances in Use of Capsule-Based Fluorescent Sensors for Measuring Acidification of Endocytic Compartments in Cells with Altered Expression of V-ATPase Subunit V1G1.

Advances in Use of Capsule-Based Fluorescent Sensors for Measuring Acidification of Endocytic Compartments in Cells with Altered Expression of V-ATPase Subunit V1G1.

ACS applied materials & interfaces (2015-06-19)
Maria De Luca, Marzia M Ferraro, Raimo Hartmann, Pilar Rivera-Gil, Andreas Klingl, Moritz Nazarenus, Agnese Ramirez, Wolfgang J Parak, Cecilia Bucci, Rosaria Rinaldi, Loretta L del Mercato
RESUMEN

Acidification of eukaryotic cell compartments is accomplished by vacuolar H+-ATPases (V-ATPases), large multisubunit complexes able to pump protons into the lumen of organelles or in the extracellular medium. V-ATPases are involved in a number of physiological cellular processes, and thus regulation of V-ATPase activity is of crucial importance for the cell. Indeed, dysfunction of V-ATPase or alterations of acidification have been recently recognized as key factors in a variety of human diseases. In this study, we applied capsule-based pH sensors and a real-time tracking method for investigating the role of the V1G1 subunit of V-ATPases in regulating the activity of the proton pump. We first constructed stable cell lines overexpressing or silencing the subunit V1G1. Second, we used fluorescent capsule-based pH sensors to monitor acidification before and during internalization by modified and control living cells. By using a simple real-time method for tracking capsule internalization, we were able to identify different capsule acidification levels with respect to each analyzed cell and to establish the kinetics for each. The intracellular pH measurements indicate a delay in acidification in either V1G1-overexpressing or V1G1-silenced cells compared to controls. Finally, in an independent set of experiments, we applied transmission electron microscopy and confocal fluorescence microscopy to further investigate the internalization of the capsules. Both analyses confirm that capsules are engulfed in acidic vesicular structures in modified and control cell lines. The use of capsule-based pH sensors allowed demonstration of the importance of the V1G1 subunit in V-ATPase activity concerning intravesicular acidification. We believe that the combined use of these pH-sensor system and such a real-time method for tracking their internalization path would contribute to systematically measure the proton concentration changes inside the endocytic compartments in various cell systems. This approach would provide fundamental information regarding molecular mechanisms and factors that regulate intracellular acidification, vesicular trafficking, and cytoskeletal reorganizations.

MATERIALES
Referencia del producto
Marca
Descripción del producto

Sigma-Aldrich
Penicilina- Estreptomicina, Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
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Sigma-Aldrich
Ácido etilenodiaminotetraacético disodium salt dihydrate, suitable for electrophoresis, for molecular biology, 99.0-101.0% (titration)
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L-Glutamina solution, 200 mM, solution, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture
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Medio de Eagle modificado de Dulbecco, glucosa elevada, With 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
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Cloruro de calcio solution, BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O
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Calcium chloride, anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0%
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Ethylenediaminetetraacetic acid solution, 0.02% in DPBS (0.5 mM), sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
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Fluorescein 5(6)-isothiocyanate, BioReagent, suitable for fluorescence, mixture of 2 components, ≥90% (HPLC)
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Luminol, 97%
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Ethylenediaminetetraacetic acid, anhydrous, crystalline, BioReagent, suitable for cell culture
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Ethylenediaminetetraacetic acid, 99.995% trace metals basis
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Carbonato de sodio, anhydrous, powder, 99.999% trace metals basis
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Calcium chloride, anhydrous, powder, 99.99% trace metals basis
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Luminol, ≥97% (HPLC)
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Ácido etilenodiaminotetraacético disodium salt dihydrate, Sigma Grade, suitable for plant cell culture, 98.5-101.5%
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Rhodamine B isothiocyanate, mixed isomers, BioReagent, suitable for protein labeling
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Rhodamine B isothiocyanate, mixed isomers
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Ethylenediaminetetraacetic acid, ACS reagent, 99.4-100.6%, powder
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Ethanesulfonic acid, 95%
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Ácido etilenodiaminotetraacético disodium salt dihydrate, ACS reagent, 99.0-101.0%
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Calcium chloride, AnhydroBeads, −10 mesh, ≥99.9% trace metals basis
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Fluorescein 5(6)-isothiocyanate, ≥90% (HPLC)
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Fluorescein isothiocyanate isomer I, ≥97.5% (HPLC)
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Carbonato de sodio, BioUltra, anhydrous, ≥99.5% (calc. on dry substance, T)
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Carbonato de sodio, BioXtra, ≥99.0%
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Ethylenediaminetetraacetic acid, anhydrous, BioUltra, ≥99% (titration)
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Phenol Red, powder, BioReagent, suitable for cell culture
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Ácido etilenodiaminotetraacético disodium salt dihydrate, reagent grade, 98.5-101.5% (titration)
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Fluorescein isothiocyanate isomer I, ≥97.5% (HPLC)
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Ácido etilenodiaminotetraacético disodium salt dihydrate, meets analytical specification of Ph. Eur., BP, USP, FCC, 99.0-101.0%
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