DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7)实验方案与疑难解答

产品编号11175025910

实验方案

DIG RNA标记效率评估：
在μg级测定标记效率（标准标记反应的预计产量为每μg线性DNA模板经过DIG RNA标记反应后可得到20 μg的DIG标记RNA）。
罗氏公司建议取少量产物上样到琼脂糖凝胶。通过琼脂糖凝胶电泳（例如，甲醛凝胶或非变性凝胶）和溴化乙锭(EB)染色可分析RNA转录本。

注意：凝胶电泳虽然可以检查RNA探针的完整性，但是无法对其定量。

由PCR产物可直接生成DIG标记RNA探针，无需将其亚克隆至表达载体：
只要PCR引物包含适宜的RNA聚合酶启动子序列。
详细的实验方案请参阅技术技巧(Technical Tip)文档。

模板性质：
进行转录反应时，环状或缺口的质粒DNA会干扰转录，导致效率下降和产生非特异性转录本。最好只使用纯化的质粒DNA，保证限制性内切酶完成消化。为了获得最佳结果，建议使用High Pure Plasmid Isolation Kit（超纯质粒分离试剂盒）纯化质粒。每微克DNA取10单位限制酶至少消化3小时。模板务必要高纯度且不含盐、蛋白、RNA酶等污染物。为了取得最佳结果，可先通过凝胶纯化线性DNA模板，接着用离心柱进一步纯化，例如，可使用High Pure PCR Product Purification kit（超纯PCR产物纯化试剂盒）。也可通过酚/氯仿提取法和乙醇沉淀法纯化。用无RNA酶水（PCR级水）重悬模板DNA，取少量样品通过凝胶电泳检验大小、纯度和浓度，最后取1 μg模板DNA进行体外转录反应。

疑难解答

合成的RNA探针在凝胶电泳中生成不止一条带的可能原因：

可能原因1：
RNA二级结构在非变性条件下（简单琼脂糖凝胶）无法分离以至于形成两条带。可改用MOPS/甲醛凝胶（常用作northern凝胶）或PAGE凝胶。

可能原因2：
由于没有经过DNA酶消化处理，上样的RNA探针中仍存在微量的RNA探针制备用DNA模板。使用DIG RNA标记试剂盒提供的对照时，请查看包装说明书了解其所含DNA片段详情。

可能原因3：
建议根据所用的DNA构建体，线性化获得5’ -粘性末端：
完成DIG标记反应后，通过凝胶电泳检验结果，确保转录本大小符合预期。某些DNA序列会使RNA聚合酶制造流产性或短的转录本。要解决这个问题，可将DNA序列按多克隆位点的反方向重新克隆到载体中，用另一种RNA聚合酶转录同一条DNA链，或转录模板DNA的另一条链。

带3`-粘性末端或平末端的DNA模板因“run on”转录有时会从“错误”的那条DNA链生成不需要的转录本。为了防止这一点,可使用形成5`-粘性末端的限制性内切酶。