Black Hole Quencher™
흔히 사용되는 두 가지 소광제 TAMRA™와 DABYCL은 qPCR의 한계 감도와 유연성을 제한합니다. TAMRA는 다크 소광제가 아니므로 자체 자연 형광으로 인해 전반적인 배경에서의 증가에 기여합니다. DABCYL은 다크 소광제이지만 480 nm 이상을 발산하는 리포터 재료와 불량하게 중첩되는 부적절한 흡광 풋프린트를 가지고 있습니다(그림 2).
그림 2.DABCYL-T9의 흡광 스펙트럼과 흔히 사용되는 리포터 6-FAM™, TET™, JOE™의 방출 스펙트럼. DABCYL은 poly-T 흡광도(260 nm)에서 정규화되었습니다. RFU = 상대적 형광 단위.
DABYCL은 분자 비콘(쌍을 이룬 리포터 및 소광제와 함께 정적 소광을 활용하는 구조적 프로브)에 대해 우수한 효과를 보입니다. 하지만 최대 흡광도(474 nm)가 그림 2에 나온 리포터의 최댓값보다 낮으므로, 이중 표지 프로브(리포터와 소광제가 분리되어 있고 FRET 소광을 활용하는 선형 프로브)에 대해 선택하는 것은 부적절합니다.
Black Hole Quencher™ 1(BHQ™-1)(최대 흡광도: 534 nm)은 DABCYL보다 높은 파장에서 흡수되며 FAM, TET, JOE의 방출 최댓값과 직접 중첩될 수 있습니다. 이는 정적 소광 및 FRET 소광 효율을 대폭 증가시키므로 분자 비콘 및 이중 표지 프로브에 탁월한 소광제입니다. BHQ™-1, BHQ™-2, BHQ™-3는 그림 3에 나온 것처럼 480 nm부터 IR 근처에 이르는 스펙트럼을 포괄하므로, 이 범위 내 어디서든 방출되는 리포터를 활용할 수 있습니다.
그림 3.3가지 BHQ™ 변이체(T-9에 접합되고 260 nm의 poly-T 흡광으로 정규화됨)의 흡광 스펙트럼 및 흔히 사용되는 리포터인 6-FAM, TET, HEX™, 시아닌 3, TAMRA, ROX™, LC Red 640, 시아닌 5의 방출 최댓값.
BHQ™ 프로브는 이에 상응하는 DABCYL 프로브 또는 TAMRA 프로브에 비해 스펙트럼 중첩이 보다 나을 뿐만 아니라 신호 대 잡음 비율도 훨씬 높습니다(그림 4).
그림 4.신호 대 잡음(S:N) 비율은 정확한 상보적 표적 서열의 5배 초과가 있는 상태에서 25 mer의 형광 신호를 프로브만의 형광 강도로 나누어 계산했습니다.
마지막으로, BHQ™ 변이체는 그림 5에 나온 것처럼 누화가 거의 없거나 아예 없는 상태에서 효과적으로 소광할 수 있는 리포터의 다양성이 늘어나기 때문에 단일 튜브 멀티플렉싱이 가능합니다. 이는 멀티플렉싱 분석법의 설계, 구현, 해석을 단순화합니다.
그림 5.BHQ™ 변이체의 독특한 특성 덕에 스펙트럼상 분해능이 뛰어난 리포터를 유연하게 선택할 수 있어 누화가 거의 없거나 아예 없는 단일 튜브 멀티플렉싱이 가능해집니다.
Black Hole Quencher™를 요약하면 다음과 같습니다.
- 자연 형광이 없기 때문에(빛 대신 열 방출) 배경 형광이 낮습니다
- 향상된 신호 대 잡음비로 보다 높은 감도를 제공합니다
- 멀티플렉싱을 위한 다양한 리포터를 선택할 수 있습니다
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