Sanger 염기서열분석 단계 및 기법

Sanger 염기서열분석이란 무엇입니까?

Sanger 염기서열분석은 사슬종료법으로도 알려져 있으며, DNA의 뉴클레오타이드 염기서열을 알아내는 방법입니다. 이 방법은 노벨상을 2번 수상한 Frederick Sanger가 동료들과 함께 1977년에 개발한 방법이며, 그래서 Sanger 염기서열분석이라는 이름이 붙었습니다.

DNA의 일반적인 구조를 검토하려면 그림 2를 확인하십시오.

Sanger 염기서열분석은 어떻게 작동합니까?

Sanger 염기서열분석은 수동 또는 보다 일반적으로는 염기서열분석 기기를 통한 자동화 방식으로 수행될 수 있습니다(그림 1). 각 방법은 아래에 기술한 3개의 기본 단계를 따릅니다.

그림 1. 자동화 Sanger 염기서열분석의 기본 3단계.

Sanger 염기서열분석 단계

Sanger 염기서열분석에는 3개의 주요 단계가 있습니다.

1. 사슬종료 PCR을 위한 DNA 염기서열

관심 DNA 염기서열은 사슬종료 PCR로 불리는 특별한 종류의 PCR을 위한 주형으로서 사용됩니다. 사슬종료 PCR은 표준 PCR처럼 작동하지만, 디데옥시리보뉴클레오타이드(ddNTP)라고도 불리는 변형된 뉴클레오타이드(dNTP)가 추가된다는 한 가지 주된 차이점이 있습니다. 표준 PCR의 연장 단계에서, DNA 중합효소는 마지막 뉴클레오타이드의 자유 3’-OH 작용기와 다음 5’-인산염 사이의 phosphodiester 결합 형성을 촉매로 삼아 dNTP를 성장하는 DNA 가닥에 추가합니다(그림 2).

사슬종료 PCR의 경우, 사용자는 PCR 반응에서 낮은 비율의 사슬종료 ddNTP를 일반적인 dNTP에 혼합합니다. ddNTP에는 phosphodiester 결합 형성에 필요한 3’-OH 작용기가 없으므로, DNA 중합효소가 ddNTP와 무작위로 결합하면서 연장이 중단됩니다. 사슬종료 PCR의 결과로 관심 DNA 염기서열에 대한 수백만에서 수십억 개의 올리고뉴클레오타이드 사본이 생기며, 5’-ddNTP에 의해 무작위 길이(n)로 종결됩니다.

수동 Sanger 염기서열분석에서는, 4가지 PCR 반응이 설정되며 각각의 반응은 혼합된 ddNTP(ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP) 중 한 가지씩만 포함합니다.

자동화 Sanger 염기서열분석은 모든 ddNTP가 하나의 반응에서 혼합되며, 4가지 dNTP 각각에 고유한 형광 표지를 합니다.

2. 겔 전기영동에 의한 크기 구분

두 번째 단계로, 사슬종료 올리고뉴클레오타이드는 겔 전기영동을 통해 크기별로 구분됩니다. 겔 전기영동에서, DNA 시료를 겔 매트릭스의 한쪽 끝에 넣어 전류를 흘립니다. DNA는 음전하이므로, 올리고뉴클레오타이드는 겔의 반대쪽에 양극을 향해 이끌려갑니다. 모든 DNA 절편은 질량 단위당 동일한 전하를 가지며, 올리고뉴클레오타이드가 움직이는 속도는 크기로만 측정될 것입니다. 절편이 작을수록 겔을 통해 이동하는 동안 겪게 될 마찰이 더 적으며, 더 빨리 움직일 것입니다. 결과적으로, 올리고뉴클레오타이드는 가장 작은 크기부터 가장 큰 크기까지 정렬되며 겔의 바닥에서 상층 방향으로 판독하게 됩니다.

수동 Sanger 염기서열분석에서는, 4가지 PCR 반응 각각에 대한 올리고뉴클레오타이드가 겔의 개별 4개 레인에서 분리됩니다. 이를 통해 사용자는 어떤 올리고뉴클레오타이드가 어떤 ddNTP에 해당하는지 알 수 있습니다.

자동화 Sanger 염기서열분석에서는, 모든 올리고뉴클레오타이드가 염기서열분석 기기 내에 있는 하나의 모세관 겔 전기영동에서 분리됩니다.

3. 겔 분석 및 DNA 염기서열의 확인

마지막 단계는 단순히 겔을 판독하여 투입된 DNA의 염기서열을 확인하는 것입니다. DNA 중합효소는 5’에서 3’ 방향으로만 DNA를 합성하며 제공된 프라이머에서 시작하므로, 각 말단 ddNTP는 원래 염기서열에서 특정 뉴클레오타이드와 일치하게 됩니다(예: 가장 짧은 절편은 5’ 말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드에서 종료되며, 두 번째로 짧은 절편은 5’ 말단으로부터 두 번째 뉴클레오타이드에서 종료되어야 합니다). 그러므로 겔 밴드를 가장 작은 영역부터 큰 영역 방향으로 판독하면, 원래 DNA 가닥의 5’에서 3’ 방향으로 염기서열을 알아낼 수 있습니다.

수동 Sanger 염기서열분석에서, 사용자는 겔의 4개 레인 모두를 한 번에 판독할 수 있습니다. 바닥에서 상층 방향으로 이동하면서 각 밴드에 대한 말단 ddNTP 식별을 확인하기 위해 레인을 사용합니다. 예를 들어, 바닥 쪽 밴드가 컬럼 내에서 ddGTP와 일치하는 것으로 밝혀지면, 가장 작은 PCR 절편은 ddGTP로 종료되며, 원래 염기서열의 5’ 말단으로부터 첫 번째 뉴클레오타이드는 guanine(G) 염기를 가집니다.

자동화 Sanger 염기서열분석에서, 컴퓨터는 모세관 겔의 각 밴드를 순서대로 판독하며 각 말단 ddNTP의 정체를 판정하기 위해 형광물질을 사용합니다. 간단히 말해, 레이저로 각 밴드에 있는 형광 태그를 자극하면 컴퓨터가 그 결과로 방출되는 빛을 검출합니다. 4가지 ddNTP는 각기 다른 형광 표지로 태그되었으므로, 방출되는 빛은 말단 ddNTP의 정체와 직접적으로 관련이 있습니다. 출력은 크로마토그램이라고 부르며, 각 뉴클레오타이드의 형광 피크를 주형 DNA의 길이에 따라 보여줍니다.

그림 2. DNA 구조 도식. DNA는 이중나선을 형성하며 서로의 주변을 감는 두 개의 가닥으로 구성된 분자입니다. 각 가닥은 데옥시리보뉴클레오타이드(dNTP)라고 불리는 분자의 문자열로 구성되어 있습니다.

각각의 dNTP는 인산염 그룹 하나, 당 그룹 하나, 4개의 질소 염기[adenine (A), thymine (T), guanine (G) 또는 cytosine (C)] 중 하나로 구성되어 있습니다. dNTP는 하나의 dNTP에 있는 당과 그 다음 dNTP에 있는 인산염 그룹 사이의 phosphodiester 공유결합에 의해 선형적으로 연결되어 있습니다. 이런 반복되는 당-인산염 패턴은 당-인산염 뼈대를 이룹니다.

두 개의 개별 가닥에 있는 질소 염기는 상보적 염기 사이에서 수소결합에 의해 서로 결합하여 DNA 이중끈나선을 형성합니다.

Sanger 염기서열분석 결과를 판독하는 방법

Sanger 염기서열분석 결과의 판독은 두 개의 상보적 DNA 가닥 중 어느 것이 관심 대상이고 어떤 프라이머가 사용 가능한지에 따라 달라집니다. DNA 가닥 2개를 A와 B라고 하고 가닥 A가 관심 대상이지만 프라이머는 가닥 B에 더 적합한 경우, 결과물 절편은 가닥 A로 식별될 것입니다. 반대로, 가닥 A가 관심 대상이고 프라이머도 가닥 A에 더 적합한 경우, 결과물은 가닥 B로 식별될 것입니다. 따라서, 결과물은 가닥 A로 다시 전환되어야 합니다.

그러므로 관심 염기서열이 "TACG"로 판독되고 프라이머가 해당 가닥에 가장 적합한 경우 결과물은 "ATGC"가 될 것이므로, "TACG"로 판독되어야 합니다. 하지만 프라이머가 상보적 가닥("ATGC")에 더 적합하다면, 결과물은 "TACG"로 판독되고 이것은 올바른 염기서열입니다.

요약하자면, 시작하기 전에 무엇을 표적으로 할 것인지 그리고 거기에 어떻게 도달할 것인지 알아야 합니다. 이를 염두에 두고 다음 예시(TACG -> ATGC -> TACG)를 확인해 보십시오. 디데옥시리보뉴클레오타이드 라벨이 T = 노란색, A = 분홍색, C = 어두운 파란색, G = 밝은 파란색이라고 했을 때, 결과적으로 프라이머-A, 프라이머-AT, 프라이머-ATG, 프라이머-ATGC의 짧은 염기서열을 얻을 것입니다. 절편이 일단 전기영동에 의해 분리되면, 레이저는 길이(분홍색, 노란색, 밝은 파란색, 어두운 파란색) 순서대로 절편을 판독하고 크로마토그램을 생성합니다. 컴퓨터는 문자를 전환하게 되며 최종 염기서열이 TACG로 교정됩니다.

Sanger 염기서열분석 vs. PCR

Sanger 염기서열분석 및 PCR은 비슷한 출발 물질을 사용하며 서로와 함께 사용할 수 있지만, 서로를 대체할 수는 없습니다.

PCR은 DNA 전체를 증폭하는 데 사용됩니다. 다양한 길이의 절편이 우연히 생성될 수도 있지만(예를 들어 DNA 중합효소가 떨어져 나간 경우), 목표는 전체 DNA 염기서열을 복제하는 것입니다. 이를 달성하기 위한 "재료"는 표적 DNA, 뉴클레오타이드, DNA 프라이머, DNA 중합효소(특히 Taq 중합효소는 PCR에서 필요한 고온에서의 생존 능력이 있습니다)입니다.

반대로, Sanger 염기서열분석의 목표는 표적 DNA의 전장에 이르는 모든 가능한 길이의 DNA를 생성하는 것입니다. 이것이 바로 PCR 출발 물질에 더하여 디데옥시리보뉴클레오타이드가 필요한 이유입니다.

Sanger 염기서열분석 및 PCR은 Sanger 염기서열분석 프로토콜을 위해 출발 물질을 생성할 때 함께 사용할 수 있습니다. PCR는 염기서열분석을 할 DNA의 많은 사본을 만들어내는 데 사용될 수 있습니다.

작업할 주형이 한 가지 이상이면 Sanger 프로토콜이 더 효율적입니다. 표적 염기서열이 1,000개의 뉴클레오타이드 길이이며 주형 사본이 하나밖에 없으면, 1,000개의 태그된 절편을 생성하는 데 더 오래 걸릴 것입니다. 하지만 주형 사본이 여러 개 있는 경우, 이론적으로는 태그된 절편 1,000개 모두를 생성하는 데 드는 시간이 감소할 것입니다.