올리고뉴클레오타이드의 어닐링(Annealing) 프로토콜

• 약어
• DNA/RNA 어닐링 장비 및 용품
• DNA/RNA 어닐링 방법
• DNA 어닐링을 위한 완충액 조제법

이 프로토콜은 상보적 염기서열을 가진 2개의 단일 나선 올리고뉴클레오타이드 어닐링을 위한 것입니다(그림 1). 가열 후 냉각은 혼성체화(hybridization)를 용이하게 합니다.

그림 1. 어닐링 반응의 예시. 가열하면 모든 수소결합이 ‘깨지므로’, 각 올리고뉴클레오타이드 내의 모든 2차 구조를 파괴합니다. 이후 서서히 냉각시키면 혼성체화가 용이해지는데, 새로운 수소결합이 상보적 염기서열 사이에 형성되기 때문입니다.

정의 / 약어

EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid

NaCl: Sodium Chloride

Trizma^® 염기: Tris [Tris(hydroxymethyl)aminomethane]의 브랜드 이름

Oligo: Oligonucleotide 또는 oligomer의 약자. 올리고뉴클레오타이드는 짧은 단일 나선 DNA 또는 RNA 분자이며, 어닐링(가열 또는 융해)되고 나서야 적합한 상보적 DNA 또는 RNA 가닥과 결합하여 이중 가닥을 형성할 수 있습니다.

DNA 어닐링: 이 페이지에서는 모든 올리고뉴클레오타이드를 위한 어닐링 절차에 대해 논의합니다. 때때로 어닐링은 해당 절차가 RNA에 대해서도 사용됨에도 불구하고 DNA 어닐링이라고 불립니다. 어닐링은 상보적 염기서열을 가진 2개의 단일 나선 올리고뉴클레오타이드를 가열 및 냉각하는 과정입니다. 가열은 모든 수소결합을 깨뜨리며, 냉각은 새로운 결합이 염기서열 사이에 생성될 수 있게 합니다.

DNA/RNA 어닐링 장비 및 용품

• 가열 블록 또는 유전자증폭기
• 2 mL 원심분리용 튜브
• 피펫 팁
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA(제품번호 E9884)
• NaCl(제품번호 S3014)
• Trizma^® 염기(제품번호 93362)
• 상보적 염기서열을 가진 2개의 단일 나선 올리고뉴클레오타이드

DNA/RNA 어닐링 방법

어닐링 과정은 2개의 주요 단계로 나뉩니다. 1) 용해 2) 어닐링(가열 블록 또는 유전자증폭기 사용)

올리고 용해

각 올리고뉴클레오타이드는 정확히 측정된 양으로 배송되지만, 최상의 결과를 위해 분광광도계로 검증하여 각각 같은 양의 올리고뉴클레오타이드가 반응에 추가되는지 확인합니다.

• 각 올리고뉴클레오타이드를 어닐링 완충액 부피에 따라 용해시켜서(아래 완충액 조제법 참고) 각각 같은 농도가 되게 합니다.
• 각 올리고뉴클레오타이드의 농도는 원하는 이합체 올리고뉴클레오타이드 농도의 2배가 필요합니다.

예시

원하는 이합체 올리고뉴클레오타이드 농도는 50 µM입니다.

1. 올리고뉴클레오타이드 1: 10.55 OD(312.6 µg, 49.9 nmol)로 제공됩니다. 분광광도계로 측정된 OD 양을 검증하십시오.
2. 올리고뉴클레오타이드 2: 9.04 OD(279.7 µg, 45.9 nmol)로 제공됩니다. 분광광도계로 측정된 OD 양을 검증하십시오.
3. 각 올리고뉴클레오타이드 저장용액은 원하는 이합체 올리고뉴클레오타이드 농도의 2배가 필요하며, 즉, 각 저장용액은 100 µM이 되어야 합니다.
   1. 올리고뉴클레오타이드 1에 어닐링 완충액 49.9 x 10 = 499 µL를 추가하여 100 µM 저장용액을 만듭니다.
   2. 올리고뉴클레오타이드 2에 어닐링 완충액 45.9 x 10 = 459 µL를 추가하여 100 µM 저장용액을 만듭니다.

*이 계산은 100 µM 용액을 만들 때만 적용되는 간단한 방법이며, 여기서는 예시로만 사용됩니다. 다양한 올리고뉴클레오타이드 농도 계산에 대해 자세히 알아보려면, 처리 지침 및 안정성을 확인하십시오.

Oligo 어닐링

가열 블록

1. 같은 양의 동일한 몰 농도를 가진 올리고뉴클레오타이드를 마이크로튜브에서 혼합합니다.
2. 마이크로튜브를 95°C에서 5분 동안 배양합니다.
3. 마이크로튜브가 실온이 될 때까지 서서히 냉각시킵니다(< 60분).

유전자증폭기

가열 블록도 작동하겠지만, 유전자증폭기는 더 일관된 과정을 가능하게 합니다.

1. 같은 양의 동일한 몰 농도를 가진 올리고뉴클레오타이드를 PCR 튜브에서 혼합합니다.
2. 다음의 열 프로파일을 사용합니다.
   1. 95°C까지 가열하고 해당 온도를 2분 동안 유지합니다.
      
   2. 25°C까지 45분 이상 냉각시킵니다.
      
   3. 임시 보관을 위해 4°C까지 냉각시킵니다.
3. PCR 튜브를 잠시 원심분리하여 모든 수분을 뚜껑으로부터 제거합니다.

가열 블록 또는 유전자증폭기의 사용 후, 이합체 올리고뉴클레오타이드는 사용 또는 보관할 준비가 됩니다. 올리고뉴클레오타이드 보관에 대해 자세히 알아보려면, 처리 지침 및 안정성을 확인하십시오.

DNA 어닐링을 위한 완충액 조제법

모든 완충액은 Milli-Q^® 워터로 만듭니다.

어닐링 완충액 조성 (1X)

• 10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0
• 50 mM NaCl
• 1 mM EDTA

연결효소 완충액 조성 (1X)

이 완충액은 일반적으로 T4 DNA 연결효소와 함께 사용됩니다.

• 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
• 10 mM MgCl₂
• 1 mM ATP
• 10 mM DTT

인산화효소 완충액 조성 (1X)

이 완충액은 일반적으로 T4 polynucleotide 인산화효소와 함께 사용됩니다.

• 70 mM Tris-HCl, pH 7.6
• 10 mM MgCl₂
• 5 mM DTT