seMpai：高い溶解性を有するTokeOni類縁体

はじめに

生体組織で進行する生命現象を非侵襲的かつ高感度に可視化できる生物発光イメージングは、この10年程の間に、生物医学研究に不可欠な技術となった^1-3。マウスなどの小動物の生物発光イメージングには、ホタルルシフェラーゼ（Fluc）とD-ルシフェリンを用いた発光システムが長らく用いられてきたが、可視領域の発光（最大発光波長 λ_max = 560 nm）を利用するため、組織中のヘモグロビンやメラニンに吸収されやすく^4,5、生体深部組織のイメージングに課題を残していた。そのため、生体組織透過性に優れる近赤外領域（>650 nm）の光を生成する生物発光システムの開発が進められてきた。電気通信大学の牧らは、Flucと反応して、近赤外発光（λ_max= 677 nm）を生成する合成基質「TokeOni（AkaLumine-HCl、808350）」を見出した⁶。TokeOniによって生成される近赤外発光は、生体深部組織を高感度に観察できる⁷。しかし、TokeOniはPBSのような中性pHの緩衝液に溶解度が低く（< 1 mM）、滅菌水には高濃度に溶解するが溶液のpHが酸性になるため、幾つかの生物学的実験に適していなかった。

seMpaiを用いたイメージング

そこで開発された合成基質が「seMpai（902268）」である。seMpaiは、TokeOniと同様にATPとマグネシウムイオン存在下で、Flucとの反応から近赤外発光（λ_max = 675 nm）を生成する（図1）。また、中性pHの緩衝液へ高い溶解性（> 60 mM）を示し、-80℃で長期間保存可能である。

図1 seMpai（902268）とD-ルシフェリン、TokeOni（808350）の化学構造と発光スペクトル

肺転移モデルマウスを使った評価から、seMpaiはD-ルシフェリンよりも高感度な深部組織のイメージングを可能にすることが明らかになり（図2）、その感度はTokeOniと同等であった⁸。これら結果から、seMpaiは生物学実験により適した近赤外発光基質といえる。

図2 seMpaiによる肺転移病巣の高感度イメージング。D-ルシフェリンもしくはseMpaiを投与（120 μmol/kg）して15分後に撮像した代表的なイメージを示した。マウス肺転移は、B6アルビノマウスへのLLC/Fluc細胞の静脈内注射の2週間後に確認された。

イメージング プロトコール

seMpaiをリン酸緩衝生理食塩水（pH = 7.4）に30~60 mMの濃度で溶解し、使用前に-80℃で保存する。腫瘍を有するマウスにseMpaiを腹腔内投与する（120 μmol/kg）。腫瘍病変からの生物発光シグナルは、典型的には、基質投与の10~15分後にピーク強度を示す。腫瘍を有するマウスモデルにおける生物発光シグナルの経時変化を解明するためには、予備実験が推奨される。

References

1. Rehemtulla A, Stegman LD, Cardozo SJ, Gupta S, Hall DE, Contag CH, Ross BD. 2000. Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging. Neoplasia. 2(6):491-495. https://doi.org/10.1038/sj.neo.7900121

2. Luker KE, Smith MCP, Luker GD, Gammon ST, Piwnica-Worms H, Piwnica-Worms D. 2004. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(33):12288-12293. https://doi.org/10.1073/pnas.0404041101

3. Kuchimaru T, Kataoka N, Nakagawa K, Isozaki T, Miyabara H, Minegishi M, Kadonosono T, Kizaka-Kondoh S. 2018. A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries. Nat Commun. 9(1): https://doi.org/10.1038/s41467-018-05366-3

4. Dawson JB, Barker DJ, Ellis DJ, Cotterill JA, Grassam E, Fisher GW, Feather JW. 1980. A theoretical and experimental study of light absorption and scattering by in vivo skin. Phys.Med. Biol.. 25(4):695-709. https://doi.org/10.1088/0031-9155/25/4/008

5. Weissleder R, Ntziachristos V. 2003. Shedding light onto live molecular targets. Nat Med. 9(1):123-128. https://doi.org/10.1038/nm0103-123

6. Iwano S, Obata R, Miura C, Kiyama M, Hama K, Nakamura M, Amano Y, Kojima S, Hirano T, Maki S, et al. 2013. Development of simple firefly luciferin analogs emitting blue, green, red, and near-infrared biological window light. Tetrahedron. 69(19):3847-3856. https://doi.org/10.1016/j.tet.2013.03.050

7. Kuchimaru T, Iwano S, Kiyama M, Mitsumata S, Kadonosono T, Niwa H, Maki S, Kizaka-Kondoh S. 2016. A luciferin analogue generating near-infrared bioluminescence achieves highly sensitive deep-tissue imaging. Nat Commun. 7(1): https://doi.org/10.1038/ncomms11856

8. Saito R, Kuchimaru T, Higashi S, Lu SW, Kiyama M, Iwano S, Obata R, Hirano T, Kizaka-Kondoh S, Maki SA. 2019. Synthesis and Luminescence Properties of Near-Infrared N-Heterocyclic Luciferin Analogues for In Vivo Optical Imaging. BCSJ. 92(3):608-618. https://doi.org/10.1246/bcsj.20180350

9. Nakayama J, Saito R, Hayashi Y, Kitada N, Tamaki S, Han Y, Semba K, Maki SA. High Sensitivity In Vivo Imaging of Cancer Metastasis Using a Near-Infrared Luciferin Analogue seMpai. IJMS. 21(21):7896. https://doi.org/10.3390/ijms21217896

10. Fukuchi M, Saito R, Maki S, Hagiwara N, Nakajima Y, Mitazaki S, Izumi H, Mori H. 2020. Visualization of activity-regulated BDNF expression in the living mouse brain using non-invasive near-infrared bioluminescence imaging. Mol Brain. 13(1): https://doi.org/10.1186/s13041-020-00665-7

11. Saito-Moriya R, Nakayama J, Kamiya G, Kitada N, Obata R, Maki SA, Aoyama H. How to Select Firefly Luciferin Analogues for In Vivo Imaging. IJMS. 22(4):1848. https://doi.org/10.3390/ijms22041848