Domande frequenti sui kit GenElute™-E per la purificazione del DNA e dell'RNA con un'unica centrifugazione

Quello che segue è un elenco delle domande che riceviamo più spesso in merito ai kit GenElute™-E per la purificazione del DNA e dell'RNA con un’unica centrifugazione.

Domande sulla tecnologia

Domande sulle applicazioni

Domande sul protocollo

I kit GenElute™-E per la purificazione del DNA e dell'RNA con un’unica centrifugazione si avvalgono della cromatografia negativa per isolare gli acidi nucleici. In che modo questo approccio semplifica il flusso di lavoro?

Invece di ottimizzare le fasi di adsorbimento, lavaggio ed eluizione dei tradizionali metodi di centrifugazione su silice, questa tecnologia è incentrata sulla separazione ottenuta con una sola fase di frazionamento delle biomolecole in base alle loro dimensioni, che causa la deplezione delle impurezze.

Che cosa hanno di speciale gli enzimi SmartLyse™?

Gli enzimi mirati SmartLyse™ riducono il tempo di lisi e ottimizzano l’efficienza della sequenza operativa, evitando all’operatore tutte le ripetitive manipolazioni delle provette perché non vi sono fasi di adsorbimento e lavaggio.

Spesso con le colonnine di silice, l’operatore può utilizzare un volume di eluizione minore per ottenere un campione più concentrato, oppure eluire due volte per una maggiore resa. In che cosa differisce questa tecnologia?

Quando, utilizzando la silice, si ricorre a un volume di eluizione più piccolo si può ottenere una concentrazione maggiore. Tuttavia, saranno maggiormente concentrati anche i residui dei sali e dell’etanolo usati per adsorbire e lavare il campione. Con la cromatografia negativa, il volume caricato corrisponde sostanzialmente al volume recuperato (tipicamente ~80-100 µL), che in genere è più concentrato rispetto a quello dei campioni purificati con silice. Con la silice, di solito una seconda eluizione comporta il rilascio di più contaminanti di processo e di acidi nucleici frammentati più piccoli, il che può causare una quantificazione inaccurata e sovrastima della resa.

In che modo la tecnologia GenElute™-E migliora l’accuratezza della quantificazione degli acidi nucleici?

Se per la purificazione si usa la cromatografia negativa non si introducono contaminanti di processo e, grazie all'impiego di un'unica fase di centrifugazione, si recuperano più acidi nucleici a lunghezza intera. Ciò migliora l’accuratezza della quantificazione necessaria per le applicazioni successive ed elimina i possibili contaminanti interferenti, ottimizzando così la robustezza degli esperimenti.

Quali altri vantaggi offre ai ricercatori la tecnologia GenElute™-E?

Eliminando le fasi di adsorbimento e lavaggio, questo approccio per l’isolamento degli acidi nucleici è più sostenibile, perché si riducono le provette di plastica utilizzate e gli scarti chimici. Ciò rende GenElute™-E una soluzione sostenibile perché conforme ai principi della chimica verde, quindi più vantaggiosa per tutti.

La polimerasi che uso per le mie amplificazioni è un enzima molto esigente. Questa tecnologia elimina gli ioni Mg2+ dai miei campioni?

Certo che sì! Assicurando, grazie alla deplezione degli ioni, l'ottimizzazione dei componenti del tampone enzimatico ed evitando la spiacevole “sorpresa” di incorrere in eventuali inibitori, la tecnologia GenElute™-E per la purificazione con un’unica centrifugazione garantisce maggiore robustezza alle reazioni enzimatiche a valle.

Qual è la composizione del tampone di lisi e di quello di chiarificazione una volta fluiti attraverso la resina?

La presenza di EDTA, SDS o un eccesso di sali può compromettere la reazione di PCR/sequenziamento.

Le informazioni sul tampone di lisi sono coperte da segreto industriale, ma possiamo affermare che esso non contiene sali caotropici. Le resine sono di tipo desalinizzante, quindi causano la deplezione di EDTA, SDS e sali. Questo è il bello della tecnologia!

Questa tecnologia può introdurre distorsioni nel campione?

GenElute™-E non introduce alcuna delle distorsioni possibili invece con le tecnologie di tipo “adsorbimento-lavaggio-eluizione“, dato che la separazione dipende dalle dimensioni e non da ciò che viene legato e da ciò che viene rilasciato.

È nota la stabilità del DNA purificato dopo numerosi cicli di congelamento-scongelamento?

La stabilità fluttua a causa della variabilità dei campioni [prelievo del campione, concentrazione, lunghezza dei frammenti, sequenza (contenuto di GC), conservazione prima dell’isolamento, ecc.]. Tuttavia, il tampone di eluizione del campione viene poi sostituito con un tampone di conservazione standard incluso nel kit (TE 1x).

Primo, la frammentazione e la riduzione del danno da frammentazione associate ai molteplici passaggi in centrifuga o su colonnina riguardano anche l’RNA? E secondo, in che modo la cromatografia negativa su colonna esclude le grandi proteine/glicoproteine cariche negativamente quando si vogliono estrarre gli acidi nucleici (specificamente l’RNA)?

• L'estrazione dell’RNA è soggetta alla degradazione dei frammenti, tipicamente a causa della digestione operata da enzimi presenti nel campione stesso (RNasi). Per questo è fondamentale isolare l’acido nucleico da questi enzimi il più velocemente possibile. Nella tipica procedura adsorbimento-lavaggio-eluizione, la frammentazione del campione è causata sia delle molteplici centrifugazioni sia delle fasi di adsorbimento ed eluizione della biomolecola da una membrana o da una sferetta/resina. Eliminando queste variabili di processo dalla sequenza operativa dell’isolamento dell’RNA si ha un maggior controllo sulla qualità dei frammenti nel campione finale. Tuttavia, alcune applicazioni a valle non necessitano di questo livello di controllo perché sono meno sensibili a questo tipo di degradazioni. Il controllo aiuta sicuramente, soprattutto per i campioni con rese inferiori, e può aiutare a individuare il problema in caso di insuccesso della procedura successiva.
• Sono numerosi i metodi cromatografici che sfruttano le differenze tra biomolecole per separarle, come ioni/carica nel caso della silice. La “cromatografia negativa” opera per mezzo dell'esclusione dimensionale, consentendo di raccogliere prima i prodotti di peso molecolare più alto. Capiamo che intuitivamente si associ l'uso del termine “negativa” alla carica! Le proteine digerite con gli enzimi SmartLyse™ fluiscono più lentamente nella matrice della resina rispetto alle molecole di RNA e quindi resteranno all’interno della colonnina dopo la centrifugazione. Suggerimento: se si vogliono raccogliere questi frammenti di proteine digerite insieme ad altre biomolecole di peso molecolare inferiore, dopo la purificazione basta centrifugare la colonnina a velocità maggiore per ottenere la frazione che si sposta più lentamente.