Concentrazione di virus mediante ultrafiltrazione

• Isolamento, propagazione e caratterizzazione di virus
• Metodo generale per la propagazione virale
• Concentrazione di virus per la preparazione di stock virali a titolo elevato
• Concentrazione di virus con gli ultrafiltri centrifughi Amicon^® Ultra
• Conclusioni
• Ultrafiltri centrifughi

Isolamento, propagazione e caratterizzazione di virus

Figura 1. Ultrafiltrazione per la concentrazione di virus Il fluido passa attraverso la membrana filtrante, mentre le grandi particelle virali vengono trattenute.

I metodi per l’isolamento e la propagazione dei virus sono fondamentali in lavori di ricerca, nella produzione di vaccini e nelle indagini diagnostiche. I laboratori che si occupano di ricerca di base utilizzano gli stock virali per studi di biologia dei virus e di patogenesi. La produzione di vaccini richiede la preparazione di virus su piccola e larga scala. E sebbene la maggior parte dei laboratori diagnostici ormai ricorra ad approcci non colturali per la diagnosi delle malattie virali, l'isolamento dei virus nelle colture cellulari è tuttora utile quando sono necessari isolati vitali, quando si devono differenziare i virus vitali da quelli non vitali e nei casi in cui i metodi basati sulle colture sono in grado di fornire i risultati più rapidamente dei metodi non colturali.

Si può procedere alla propagazione di virus in colture cellulari per preparare stock virali. Le cellule in coltura vengono inoculate con uno stock virale proveniente da semenza virale, una fonte commerciale, o da tessuto infetto. Dopo l’incubazione, le cellule infette vengono sottoposte a lisi per raccogliere le particelle virali; oppure si può procedere direttamente alla raccolta dei virus liberati nel surnatante cellulare. Lo stock virale viene quindi titolato, aliquotato e stoccato a −80 °C per impieghi futuri.

Anche ai fini dell’isolamento di virus da campioni clinici si ricorre alle colture cellulari per la propagazione virale. I campioni clinici vengono preparati mediante omogeneizzazione ed estrazione del campione in un mezzo liquido, che viene poi centrifugato e utilizzato per inoculare le colture cellulari.

Per ottenere stock virali con un titolo più elevato, è necessario concentrare le particelle virali purificate. Per concentrare virioni e soluzioni virali, si può ricorrere ai dispositivi da ultrafiltrazione centrifuga Amicon^® Ultra e Centricon^® Plus con membrana in cellulosa rigenerata (Figura 1). Il presente protocollo descrive l’impiego degli ultrafiltri centrifughi Amicon^® e Centricon^® per la concentrazione di tre tipi di virus comuni: lentivirus, adenovirus e virus adenoassociati (AAV).

Metodo generale per la propagazione virale

1. Cellule di packaging: le cellule ospiti vengono piastrate e coltivate fino a raggiungere una confluenza dell’80-85%.
2. Trasfezione: le cellule vengono infettate con particelle virali vitali
3. Raccolta del virus: a seconda del virus, i virioni ricombinanti vengono purificati dal surnatante cellulare o dal pellet di cellule, oppure da entrambi. Per liberare le particelle virali dalle cellule, si applicano quattro cicli di congelamento/scongelamento. Si separano quindi i detriti cellulari dal lisato cellulare mediante centrifugazione. 
   
4. Purificazione del virus: il virus viene purificato dal lisato cellulare mediante ultrafiltrazione su gradiente di densità o cromatografia su colonna/ membrana.
5. Si concentrano le soluzioni contenenti le particelle virali purificate e si sostituisce il tampone con una soluzione di stoccaggio opportuna ricorrendo alla dialisi passiva, alla diafiltrazione o all’ultrafiltrazione centrifuga con le unità Amicon^® Ultra o Centricon^® Plus 70.

Concentrazione di virus per la preparazione di stock virali a titolo elevato

Per produrre stock virali a titolo elevato, è necessario procedere alla concentrazione del virus purificato mediante ultrafiltrazione centrifuga. Scegliere correttamente l’unità filtrante, il materiale della membrana, il taglio molecolare o cut-off, la velocità e il tempo di centrifugazione e, infine, la composizione del tampone è estremamente importante per ottenere un recupero elevato di particelle virali infettive. Gli ultrafiltri centrifughi Amicon^® Ultra presentano tagli molecolari nominali (NMWL) ben precisi determinati dalla loro membrana filtrante. Per concentrare adenovirus e virus adenoassociati (AAV) ci si avvale dei dispositivi Amicon^® Ultra con membrana Ultracel^® avente NMWL di 50 kDa. Per la concentrazione dei lentivirus, si utilizzano sia le unità con NMWL di 50 kDa, sia di 100 kDa.

Fattori da considerare quando si selezionano il metodo di ultrafiltrazione e il taglio molecolare nominale della membrana:

1. dimensioni delle particelle virali: tali dimensioni possono essere stimate in base a dati pubblicati o mediante tecniche di misurazione quali la microscopia, la diffrazione laser e lo scattering dinamico della luce;
2. dimensione dei principali target della separazione in soluzione: la dimensione di proteine, anticorpi, principi attivi, sostanze chimiche o altre particelle che devono essere separate influenzerà la scelta della dimensione dei pori;
3. volume del campione: volumi da processare compresi nell’intervallo tra 0,5 e 70 mL sono compatibili con i dispositivi da ultrafiltrazione centrifuga (cUF).

Per trattenere le particelle virali, il taglio molecolare della membrana filtrante deve essere più piccolo rispetto alla particella (~2 volte più piccolo rispetto al peso molecolare della particella virale), ma abbastanza grande da permettere alle componenti più piccole di passare attraverso il filtro (Tabella 1).

Tabella 1. Indicazioni per la scelta del NMWL della membrana da ultrafiltrazione in base alle dimensioni delle particelle virali.

NMWL (kDa) della membrana da ultrafiltrazione	Dimensione nominale dei pori (nm)	Intervallo consigliato per le dimensioni nominali delle particelle da trattenere
		Diametro (nm)		Peso molecolare (kDa)
		Minimo	Massimo	Minimo	Massimo
3	0,3	1	1,5	6	20
10	1	3	9	20	90
30	3	9	15	60	180
50	5	15	30	100	300
100	10	30	90	200	900

Concentrazione di virus con gli ultrafiltri centrifughi Amicon^® Ultra

La Tabella 2 mostra i risultati della concentrazione di adenovirus, lentivirus e AAV a partire da lisati cellulari grezzi e da virus purificati mediante cromatografia. Utilizzando gli ultrafiltri centrifughi Amicon^® Ultra, le particelle virali sono state concentrate efficacemente, raggiungendo titoli elevati, con alti tassi di recupero.

Tabella 2. Concentrazione di virus con dispositivi da ultrafiltrazione. Sconsigliamo di superare le 1.013 particelle/ mL durante la concentrazione per evitare la formazione di aggregati.

Campione di partenza	Dispositivo	Titolo virale iniziale	Volume iniziale (mL)	Fattore di concentrazione	Durata della centrifugazione a 1.500 x g (min)	Recupero (%)
Adenovirus in lisato cellulare grezzo	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	27X	20	>100
Adenovirus purificati, in tampone salino 1M	Amicon® Ultra-4 50 kDa	1 x 108	4	45X	10	85
AAV in lisato cellulare grezzo	Amicon® Ultra-4 50 kDa	2 x 107	4	20X	35	50
AAV in lisato cellulare grezzo	Amicon® Ultra-15 50 kDa	2 x 107	10	25X	45	76
AAV diluiti in tampone Tris 100 mM, NaCl 250 mM	Amicon® Ultra-4 50 kDa	5 x 106	4	20X	20	100
Lentivirus in surnatante di colture cellulari	Amicon® Ultra-4 100 kDa	9 x 104	4	100X	30	>100
Lentivirus in surnatante di colture cellulari	Amicon® Ultra-4 50 kDa	9 x 104	4	100X	30	93
Lentivirus in surnatante di colture cellulari	Centricon Plus-70 100 kDa	8 x 103	65	80X	30	81

È importante ricordare che la maggior parte dei virus non può essere concentrata e conservata in modo efficiente in tamponi a basso tenore salino. La concentrazione centrifuga dei virus in soluzioni con concentrazioni saline < 250 mM causa l'aggregazione delle particelle virali e una diminuzione di infettività.

Gli stock virali concentrati possono essere sterilizzati mediante filtrazione con membrane da 0,22 µm. Le unità filtranti Ultrafree^®-MC GV sono idonee per volumi <0,5 mL.

Conclusioni

Abbiamo sviluppato un metodo per convalidare gli ultrafiltri centrifughi Amicon^® Ultra e Centricon^® Plus quali mezzi rapidi ed economicamente vantaggiosi per ottenere alti titoli virali. Si può ricorrere a questo metodo per concentrare virus da surnatanti di colture cellulari, da lisati cellulari e da altre fonti. Dopo la concentrazione, gli stock virali possono essere sterilizzati mediante filtrazione con le unità Ultrafree^®. Per raggiungere il massimo recupero di particelle virali infettive, è essenziale scegliere l’unità filtrante, la membrana, il taglio molecolare (MWCO), la velocità e la durata della centrifugazione appropriati.

Ultrafiltri centrifughi

Taglio molecolare del dispositivo, NMWL (kDa)	Ultrafiltri centrifughi Amicon® Ultra				Ultrafiltri centrifughi Centricon® Plus 70
	0,5 mL	2 mL	4 mL	15 mL	15 – 70 mL
3	UFC5003		UFC8003	UFC9003	UFC7003
10	UFC5010	UFC2010	UFC8010	UFC9010	UFC7010
10 (IVD*)			UFC4010D*	UFC9010D*
30	UFC5030	UFC2030	UFC8030	UFC9030	UFC7030
50	UFC5050	UFC2050	UFC8050	UFC9050
100	UFC5100	UFC2100	UFC8100	UFC9100	UFC7100

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