Purificazione dei prodotti di reazione della marcatura di anticorpi con i filtri Amicon^® Ultra

Al termine di una reazione per la marcatura di anticorpi, utilizzando un normale filtro centrifugo Amicon^® Ultra, con qualche ciclo di diafiltrazione è possibile rimuovere efficacemente il marcatore non incorporato senza diluire il campione. Seguire il protocollo sottostante per rimuovere i marcatori fluorescenti non reagiti con gli ultrafiltri centrifughi.

Rimozione di marcatori fluorescenti non reagiti al termine di una reazione di coniugazione di anticorpi

1. Caricare la soluzione di anticorpi con marcatura fluorescente (1 mg in 2 mL) in due filtri Amicon^® Ultra-4 mL con MWCO di 10 kDa e centrifugare a 4.000 x g per 10 minuti.
2. Ridiluire i retentati (circa 50 μL ciascuno) portandoli a 2 mL con acqua e ricentrifugare. Ripetere questo passaggio due volte.
3. Al termine di ciascuna centrifugazione, mettere da parte campioni del retentato e del filtrato per le analisi in SDS-PAGE e la quantificazione mediante spettroscopia UV-Vis.

Risultati

Figura 1. Gel SDS-PAGE di BSA marcata con FITC prima e dopo ciascuno dei quattro cicli di diafiltrazione. È possibile osservare dell'FITC non incorporato nel materiale di partenza e nel primo filtrato. La maggior parte del marcatore libero viene rimossa con un ciclo di ultrafiltrazione; nei cicli successivi l'FITC libero è praticamente al di sotto della soglia di rivelazione. I risultati della determinazione della fluorescenza nei diversi campioni (Figura 2) confermano questo risultato.

Figura 2. Il segnale dovuto all’FITC libero si riduce dell’~ 80% dopo la prima ultrafiltrazione, fino a raggiungere il 98% di rimozione nei cicli di filtrazione successivi. Ciò dimostra che per la purificazione delle reazioni di marcatura delle proteine è possibile ricorrere all’ultrafiltrazione in alternativa alla gel-filtrazione.