T4455
Proteasi TEV
Sinonimo/i:
P1 protease, TEVp, Tobacco Etch Virus protease, rTEV
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About This Item
Codice UNSPSC:
12352204
NACRES:
NA.54
Prodotti consigliati
Origine biologica
microbial (Tobacco Etch virus)
Livello qualitativo
Ricombinante
expressed in E. coli
Descrizione
Contains both a histidine tag and a GST tag
Forma fisica
solution
Attività specifica
≥3,000 units/mg protein
PM
27 kDa
tecniche
protein purification: suitable
Compatibilità
suitable for purification of HIS tagged recombinant proteins
applicazioni
genomic analysis
Condizioni di spedizione
wet ice
Temperatura di conservazione
−20°C
Descrizione generale
La proteasi TEV possiede un dominio catalitico (NIa) con un peso molecolare di 27 kDa. È unico nel suo essere altamente specifico e attivo a basse temperature.
La proteasi del virus etch del tabacco (TEV) è uno strumento utile a rimuovere i tag di fusione dalle proteine ricombinanti.
Applicazioni
La proteasi TEV è stata usata per rimuovere il tag di istidina dalla protein chinasi ricombinante attivata da mitogeno 14 (MAPK14), dal frammento c-terminale della connessina 43 (Cx43) e dalla δ1-pirrolina-5-carbossilato reduttasi da Oryza sativa. È stata inoltre usata nell′eluizione di proteasomi purificati da linee cellulari della leucemia umana K562.
Azioni biochim/fisiol
La proteasi TEV immobilizzata su steptavidina-agarosio è uno strumento efficiente per la scissione delle proteine di fusione. La proteasi TEV è stata usata anche in uno studio per esaminare il trattamento proteolitico di nlrp1b per l′attività dell′inflammasoma.
La proteasi del virus etch del tabacco (TEV) subisce l′autolisi, ma le forme mutanti della proteasi TEV resistono all′autolisi. L′espressione batterica della proteasi TEV ricombinante dà luogo a una resa scarsa e a minore solubilità. L′uso della proteasi TEV con la proteina di fusione fluorescente verde supera questi ostacoli e trova applicazione nella ricerca sulla genomica strutturale.
La proteasi TEV ha una rigida sequenza di riconoscimento per la scissione di 7 aminoacidi: Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser.
Caratteristiche e vantaggi
Ingegnerizzata e purificata al meglio per una maggiore stabilità e un′elevata attività specifica in un ampio intervallo di temperature.
Proprietà fisiche
La proteasi TEV è un dominio catalitico ingegnerizzato della proteasi Nia del virus etch del tabacco. La proteasi TEV è una cisteina proteasi altamente specifica e appartiene alla famiglia della C4 peptidasi.
Una struttura modificata della proteasi TEV da 52 kDa che contiene i tag GST e di istidina per facilitare la rimozione con terreni di affinità per il glutatione o His-Select®.
Definizione di unità
Una unità di proteasi TEV scinde >85% di 3 μg di substrato di controllo in un′ora a pH 8,0, a 30 °C.
Stato fisico
Fornita come >=2 mg/mL in 25 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM di NaCl, 1 mM di TCEP e 50% di glicerolo
Soluzione acquosa con glicerolo
Nota sulla preparazione
Protocollo di scissione
Preparare un tampone di dialisi fresco. Il tampone di dialisi deve essere ottimizzato per la solubilità della proteina target e non deve contenere inibitori delle proteasi. Il tampone di dialisi deve essere anche compatibile con i processi di purificazione a valle, per esempio contenere una minima quantità di EDTA o DTT se per rimuovere lo His-tag scisso si usa una colonna HIS Select®.
Esempio di tampone di dialisi adatto: 25 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 150-500 mM di NaCl, 14 mM di β-mercaptoetanolo
L′attività di questa proteasi TEV è identica in 150 mM di NaCl o 500 mM di NaCl e 400 mM di imidazolo.
Diluire il campione di proteina target a 1-2 mg/mL con il tampone di dialisi. Questo passaggio è opzionale nel caso in cui la proteina target si aggreghi nel tampone di dialisi. Mettere da parte una piccola aliquota come controllo per l′analisi PAGE. Se si eluisce la proteina target dalla colonna HIS Select™ e l′EDTA è compatibile con la proteina, lo si può aggiungere alla concentrazione finale 0,5 mM.
Aggiungere proteasi TEV fino a un rapporto tra proteasi e proteina target di 1:100 (p/p) oppure 10.000 unità (1 mg) di proteasi TEV a 100 mg di proteina target. Non è necessario calcolare il rapporto molare. É possibile aggiungere direttamente la proteasi TEV alla proteina target. Non è necessario modificare il tampone o diluire la proteasi TEV. Il rapporto ottimale deve essere determinato in modo empirico. Un rapporto proteasi/proteina target (p/p) tra 1:50 e 1:200 dovrebbe offrire un intervallo efficace per la maggior parte delle proteine target.
Dializzare con il tampone di dialisi a 4 °C per circa 16 ore. La dialisi serve a rimuovere l′imidazolo o il glutatione se si usano colonne HIS Select® o di affinità per il glutatione per rimuovere il tag scisso o la protesi TEV dopo la scissione.
Di solito, 1 mg di proteasi TEV scinderà >90% di 100 mg di una proteina di controllo a 4 °C in 16 ore.
Preparare un tampone di dialisi fresco. Il tampone di dialisi deve essere ottimizzato per la solubilità della proteina target e non deve contenere inibitori delle proteasi. Il tampone di dialisi deve essere anche compatibile con i processi di purificazione a valle, per esempio contenere una minima quantità di EDTA o DTT se per rimuovere lo His-tag scisso si usa una colonna HIS Select®.
Esempio di tampone di dialisi adatto: 25 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 150-500 mM di NaCl, 14 mM di β-mercaptoetanolo
L′attività di questa proteasi TEV è identica in 150 mM di NaCl o 500 mM di NaCl e 400 mM di imidazolo.
Diluire il campione di proteina target a 1-2 mg/mL con il tampone di dialisi. Questo passaggio è opzionale nel caso in cui la proteina target si aggreghi nel tampone di dialisi. Mettere da parte una piccola aliquota come controllo per l′analisi PAGE. Se si eluisce la proteina target dalla colonna HIS Select™ e l′EDTA è compatibile con la proteina, lo si può aggiungere alla concentrazione finale 0,5 mM.
Aggiungere proteasi TEV fino a un rapporto tra proteasi e proteina target di 1:100 (p/p) oppure 10.000 unità (1 mg) di proteasi TEV a 100 mg di proteina target. Non è necessario calcolare il rapporto molare. É possibile aggiungere direttamente la proteasi TEV alla proteina target. Non è necessario modificare il tampone o diluire la proteasi TEV. Il rapporto ottimale deve essere determinato in modo empirico. Un rapporto proteasi/proteina target (p/p) tra 1:50 e 1:200 dovrebbe offrire un intervallo efficace per la maggior parte delle proteine target.
Dializzare con il tampone di dialisi a 4 °C per circa 16 ore. La dialisi serve a rimuovere l′imidazolo o il glutatione se si usano colonne HIS Select® o di affinità per il glutatione per rimuovere il tag scisso o la protesi TEV dopo la scissione.
Di solito, 1 mg di proteasi TEV scinderà >90% di 100 mg di una proteina di controllo a 4 °C in 16 ore.
Note legali
HIS-Select is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
HiScreen is a trademark of Cytiva
Codice della classe di stoccaggio
10 - Combustible liquids
Classe di pericolosità dell'acqua (WGK)
WGK 2
Punto d’infiammabilità (°F)
Not applicable
Punto d’infiammabilità (°C)
Not applicable
Certificati d'analisi (COA)
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