Immunoistochimica

Preparazione dei tessuti, recupero e pretrattamento dell'antigene nell'IHC

In generale, per l'analisi in IHC, i tessuti vengono fissati, inclusi in paraffina e sezionati utilizzando un microtomo. Una fase cruciale dopo la preparazione iniziale del tessuto consiste nel recupero dell'antigene. Questo passaggio è necessario per rompere i legami crociati ​che possono formare le proteine durante la fissazione e rendere così accessibili i siti antigenici nascosti. Le condizioni per il recupero e il pretrattamento dell'antigene vanno determinate empiricamente in quanto l'accessibilità dell'epitopo antigenico può variare in modo significativo a seconda di numerosi fattori biologici. Ad esempio, alcuni antigeni potrebbero richiedere un pretrattamento più aggressivo per "smascherare" gli epitopi in grado di legare l’anticorpo, mentre per altri antigeni il pretrattamento potrebbe non essere necessario. I metodi comunemente usati per il recupero dell'antigene sono due: il primo è il recupero dell'epitopo indotto dal calore o HIER che utilizza una fonte di calore insieme a specifici tamponi e al trattamento enzimatico (proteinasi K). Il secondo è il recupero dell’antigene indotto da proteolisi o PIER nel quale si possono utilizzare vari tipi di proteasi, come la proteinasi k, la tripsina, la chimotripsina o la pepsina.

Colorazione e rilevazione nell'IHC

Dopo la preparazione del tessuto e il pretrattamento per il recupero dell'antigene, la visualizzazione dell'interazione anticorpo-antigene può essere eseguita in diversi modi. Un metodo comune utilizza un anticorpo primario coniugato a un enzima, come la perossidasi di rafano o la fosfatasi alcalina, che catalizza una reazione producendo una colorazione. In alternativa, il metodo dell’immunofluorescenza (IF) ricorre a un anticorpo marcato con un fluoroforo, come fluoresceina, rodamina o Alexa Fluor. Un'altra opzione è quella di utilizzare un anticorpo primario privo di marcatura, rivelando indirettamente l’antigene con un anticorpo secondario marcato o mediante sistemi di rilevamento più complessi. In questo caso, è necessario determinare per ciascun saggio il titolo ottimale di entrambi gli anticorpi, primario e secondario.