GenElute™-E DNA和RNA单次离心纯化试剂盒常见问题解答

有关GenElute™-E DNA和RNA单次离心纯化和负选色谱常见问题的解答(FAQ)。

技术FAQ

应用FAQ

实验方案FAQ

GenElute™-E单次离心DNA和RNA纯化试剂盒通过负选色谱技术分离核酸。这种方法究竟如何简化工作流程呢?

负选色谱技术(negative chromatography)没有纠结于如何优化传统硅基质法的结合-洗涤-洗脱程序，而是利用生物分子的大小差异，通过一步到位的分级分离去除杂质。

SmartLyse酶有何特别之处？

多特异性的SmartLyse™复合酶缩短裂解时间，提高工作流程效率，消除洗涤结合步骤，将科研人员从繁琐的试管操作中解脱出来。

硅基质法纯化通常使用小体积洗脱来获得更加浓缩的样品或洗脱2次来提高产量。负选色谱技术有何不同之处？

硅基质法的小体积洗脱有利于提高浓度。然而，更高的浓度同样意味着结合和洗涤样品所需的盐和乙醇残留更多。对于负选色谱法，回收量基本上等于上样量（一般约为80-100 µL），浓度通常高于硅基质法分离的核酸样品。硅基质法中，第2次洗脱通常会释放更多过程污染物和小片段核酸，会导致定量不准和产量高估。

GenElute-E技术如何提高核酸定量的准确度？

负选色谱法在纯化时不会引入过程污染物，又因为减少了离心步骤，可以回收更多的全长核酸。因此提高了核酸定量的准确性，以便用于下游应用，同时消除了污染物对下游应用的干扰，使实验更加可靠。

GenElute-E还有哪些优点？

免去结合和洗涤步骤，减少了塑料管和过柱的化学废物量，使这种核酸分离方法更具可持续性。这使得GenElute™-E成为了一种造福大家的可持续的绿色化学选择。

我正在用一种很挑剔的扩增酶（聚合酶）。这种技术会去除制品中的Mg+2离子吗？

会！GenElute™-E单次离心纯化技术会去除离子杂质，确保进行酶反应缓冲液组分的浓度优化时不受“意外”的抑制剂影响，实现更可靠的下游酶促反应。

过柱（树脂）后，裂解缓冲液和澄清缓冲液的组分是什么？

EDTA、SDS或过量盐分的存在会影响PCR/测序反应……

裂解缓冲液的配方是保密的，但是它确定不含离液盐。柱子由脱盐树脂组成，因此可去除EDTA、SDS和盐类。这就是这种技术的奇妙之处！

这种技术会在样品中引入偏差因素吗？

不像“结合-洗涤-洗脱”技术是按照结合什么和洗脱什么来分离，GenElute™-E是按照大小进行分离的，因此不会引入偏差。

多次冻融循环后，纯化DNA的稳定性如何？

稳定性会随着样品差异而波动，例如，样品收集、浓度、片段长度、序列（GC含量）、分离前储存情况等。但是，可将样品缓冲液置换为试剂盒提供的标准储存缓冲液(1X TE)。

第一，样品发生剪切和离心柱多次离心造成剪切损伤的问题，在进行RNA提取时需要注意吗？第二，提取核酸时（特别是RNA），负选色谱柱是如何除去带负电的蛋白质/糖蛋白的？

• RNA提取时容易降解成片段，一般是样品中的酶切消化（RNA酶）造成的。因此，需要尽快将这些酶与核酸分离。在典型的结合-洗涤-洗脱离心制备程序中，多次离心以及与膜或微珠/树脂的结合洗脱，都会造成样品剪切。除去RNA分离过程中的这些变量，能更好地把控样品最终的片段质量。不过，某些下游应用由于对降解没有那么敏感，因此不需要这种程度的控制。总的来说，控制是有好处的，特别是样品产量偏低时，以及在下游实验失败时可帮助找出问题。
• 各种色谱方法利用生物分子的各种差异进行分离，比如与硅基质结合的离子/电荷的不同。负选色谱(Negative chromatography)依照的是大小差异（体积排阻），大分子目标物（核酸）率先过柱而被收集。负选色谱的英文“negative”的表述确实容易与负电荷混淆。对于蛋白质来说，它先被SmartLyse™酶消化成较小分子，过柱（穿过树脂基质）的速度比RNA分子慢，离心后仍然留在柱上。快速窍门：如果想要收集消化的蛋白片段和其他小的生物分子，可以在纯化后以更高转速再次离心，收集过柱较慢的组分。