封闭剂实验方案和故障排除

实验方案

制备储液（10x）

将封闭剂溶于马来酸缓冲液[100 mM马来酸，250mM NaCl, pH 7.5 (20℃)，用固体或浓缩NaOH调节pH值]，至终浓度10% (w/v)，摇匀并在加热板上加热至+60℃左右，持续大约1小时，或直到试剂完全溶解，或在微波炉中加热3到4分钟。封闭剂在溶解时必须加热，但不能煮沸。煮沸会导致试剂凝聚。当封闭剂不溶于溶液时，检查溶液的pH值，如有必要需调节pH，并继续加热。

注意：用马来酸缓冲液将10x 封闭溶液稀释至1x 封闭溶液。现用现配！

封闭试剂和套装

在原位杂交过程中，在杂交溶液中加入Roche tRNA或Roche fish精子DNA可以更有效地减少非特异性背景。 

该封闭试剂用于降低在非放射性杂交以及核酸杂交物的检测中的背景。1)可选择在检测步骤前进行封闭；使用封闭试剂或适当的抗体来源的动物血清（如羊）。抗体可使用整支标本预吸附1小时以降低背景。 

“用于ISH免疫检测”的方案

详情请参阅Roche 非放射性原位杂交手册的DIG-RNA & 组织部分。

最后一次清洗后，继续免疫检测：

将玻片放入一个含有30mL缓冲液并可盛放8个玻片的合适大小的托盘中。按如下方式进行孵育（更换托盘而不只是更换溶液，在孵育间隙清洗备用托盘以避免背景）：

1. 缓冲液1 [100mM Tris-HCl pH7.5，20 °C；150 mM NaCl] 5 分钟
2. 缓冲液2 [缓冲液 1 以及 0.5% (w/v) 封闭剂] 1 小时
3. 缓冲液3 [缓冲液 1 以及 1% (w/v) BSA； 0.3% (v/v) Triton X-100] 1 小时
4. 排干多余的缓冲液3（勿让组织变干），并加入100μL缓冲液4[缓冲液3和anti-DIG-AP 1：1000 到1：3000不等，根据您的具体靶标而定]至组织上

临用前现配

5. 在湿润的容器内室温孵育1小时
6. 在缓冲液3中清洗4次，每次20分钟
7. 在缓冲液中1中平衡5分钟
8. 在缓冲液5中孵育5分钟（100 mM Tris-HCl (pH 9.5, 20 °C；100 mM NaCl；50 mM MgCl₂）；
9. 在暗处进行显色反应（如NBT/BCIP）；盖住托盘防止蒸发；检测合适的时间间隔；终止酶反应并清洗背景。

微阵列

一般来说，Roche建议使用环氧树脂或任何其他非带电表面阵列，以尽可能降低背景。

最重要的是在添加荧光偶联抗-DIG前先添加封闭剂。Roche建议使用包含在DIG清洗液和封闭缓冲液套装中的封闭缓冲液。

首先，完成杂交后清洗阵列，然后用1%封闭试剂进行预封闭，封闭试剂溶于含0.1% Tween 20的2x PBS中。将染色标记的anti-DIG用1%的封闭剂进行稀释，封闭剂溶于含0.1% Tween20的2x PBS，应用于微阵列上。使用含0.1% Tween 20的 2x PBS进行清洗。或者，可以使用含有1% BSA的缓冲液或5% Denhardt’s试剂来代替DIG封闭剂。

故障排除

增加浓度至5%

封闭剂的浓度最高可增加至5%。这可以降低背景染色。对于大多数标准DIG应用，建议的浓度已足够。对于生物素检测，使用5%的浓度。

使用封闭剂最简单的方法是使用Roche DIG Wash and Block Buffer 套装（货号：01585762001），这是一套即用型储液。

高背景

原因可能是标记的DNA非特异性附着在蛋白质或组织中其他DNA结合分子上。为了减少高背景染色，请遵循方案帮助角给出的建议，尤其是考虑预吸附抗体混合物。