人表皮黑素细胞(HEM)
II.培养的准备工作。
- 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
- 用70％酒精对生物安全柜消毒。
- 在开始细胞培养工作之前，打开生物安全柜风机10分钟。
- 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
- 遵守标准无菌技术和安全规则：
a.不要用嘴吸移液管。
b.在处理人类细胞时始终佩戴手套和护目镜，即使所有菌株均已经过测试为HIV、乙肝和丙肝病毒阴性。
c.在无菌超净台内处理所有细胞培养工作。
III.HEM培养
A. 为HEM培养准备细胞培养瓶
- 从冰箱中取出黑素细胞生长培养基。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
- 吸取15 mL人表皮黑素细胞生长培养基置于T-75培养瓶中。
*保持培养基与表面积的比例在每5 cm2 1 mL。
例如：
一个T-25培养瓶或一个60 mm组织培养皿使用5 mL培养基。
一个T-75培养瓶或一个100 mm组织培养皿使用15 mL培养基。
B. 解冻和接种HEM
- 佩戴合适的护目镜和手套，从液氮罐中取出HEM冻存管。
- 将瓶盖转动四分之一圈，以释放可能被困在螺纹中的液氮，然后重新拧紧瓶盖。
- 将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞，并在解冻过程中密切观察小管。
- 当小管中仅有少量冰时，从水浴中取出小管。请勿让细胞完全解冻。
- 在无菌生物安全柜中用70％酒精对小管外部消毒。
- 小心取下小管盖。请勿用手触摸盖子或小管的边缘，以免污染。
- 用2 mL移液管轻轻吹5次，将细胞重悬于小管中。小心不要过于剧烈地移液以免起泡。
- 用移液管从冻存管中取出细胞悬液（1 mL）,转移至含有15 mL人表皮黑素细胞生长培养基的T-75培养瓶中。
- 盖上培养瓶并轻轻摇动，使细胞均匀分布。
- 将T-75培养瓶放在37 °C、5% CO2加湿培养箱中。松开盖子以便换气。为获得最佳结果，接种后24小时之内不要扰动培养物。
- 24小时或过夜后更换为新鲜的黑素细胞生长培养基，以除去所有残留的DMSO。
- 每隔一天更换黑素细胞生长培养基，直至细胞达到60%融合。
- 当培养细胞融合率达到60%以上或周末饲喂时，将黑素细胞生长培养基用量加倍。
- 当HEM达到80%融合时，进行细胞传代。
IV.HEM传代培养
A. 准备传代试剂
- 从-20 °C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液和胰蛋白酶抑制剂，置于冰箱中解冻过夜。
- 确保解冻所有传代培养试剂。轻轻旋转每个瓶子几次，形成均匀的溶液。
- 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
- 分装胰蛋白酶/EDTA溶液。如果只需要使用一部分胰蛋白酶/EDTA溶液，则将未使用部分保存在-20 °C。
B. 准备培养瓶
- 从冰箱中取出黑素细胞生长培养基。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
- 吸取30 mL黑素细胞生长培养基置于T-175 培养瓶中（用于第IV C部分步骤15）。
C. HEM传代培养
在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化。请勿将任何试剂加热至37°C。
- 从培养瓶吸取培养基。
- 使用HBSS清洗单层细胞，并吸出溶液。
- 吸取5 mL胰蛋白酶/EDTA溶液置于T-75培养瓶中。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
- 立即吸取4 mL的溶液。
- 重新盖紧培养瓶盖子，并在倒置显微镜下在室温下监测胰蛋白酶消化过程。细胞通常需要2至4分钟才能变圆。细胞在胰酶消化过程中可能不会完全变圆，并且有些细胞可能会在脱离培养表面后依然处于消化进程中。
- 用手掌拍打培养瓶侧面，使圆细胞从培养表面释放，直至大部分细胞脱落。
- 向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液，以抑制进一步的胰酶消化活性。
- 将细胞悬浮液从培养瓶转移至50 mL无菌锥形管中。
- 再次向培养瓶中加入5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液进行清洗，并将溶液转移至同一锥形管中。
- 在显微镜下检查T-75培养瓶。如果培养瓶中剩余> 20％的细胞，请重复步骤2-9。
- 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
- 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
- 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
- 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块，使细胞重悬于 5 mL黑素细胞生长培养基中。
- 用血细胞计数板或细胞计数器计数细胞。如想使细胞快速生长，则接种密度为10,000个细胞/cm2，如想使细胞进行常规传代培养，则则接种密度为6,000个细胞/cm2。
材料
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