CT01-5
Réactif A MTT
Useful in the study of cell & mitochondrial health, MTT is a pale yellow substrate that is cleaved by living cells to yield a dark blue formazan product.
Synonyme(s) :
MTT Formazan Assay
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About This Item
Code UNSPSC :
12352207
eCl@ss :
32161000
Nomenclature NACRES :
NA.32
Produits recommandés
Niveau de qualité
Forme
solid
Fabricant/nom de marque
Chemicon®
Technique(s)
activity assay: suitable
cell based assay: suitable
Conditions d'expédition
wet ice
Description générale
Réactif A : MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium), 50 mg/flacon.
Le MTT est un substrat jaune pâle qui est clivé par les cellules vivantes pour donner un produit bleu foncé : le formazan. Ce processus nécessite des mitochondries actives, et même des cellules fraîchement mortes ne clivent pas de grandes quantités de MTT. Le réactif A est un élément du kit de test au MTT de Chemicon (réf. CT01/CT02).
Le MTT est un substrat jaune pâle qui est clivé par les cellules vivantes pour donner un produit bleu foncé : le formazan. Ce processus nécessite des mitochondries actives, et même des cellules fraîchement mortes ne clivent pas de grandes quantités de MTT. Le réactif A est un élément du kit de test au MTT de Chemicon (réf. CT01/CT02).
Application
Protocole :
1. Réaliser un test de cytotoxicité médiée par le complément, les mitogènes ou les lymphokines, selon des méthodes classiques, sur des plaques de culture tissulaire de 96 puits à fond plat de bonne qualité (p. ex. Falcon). Le volume final de milieu de culture tissulaire doit être de 0,1 ml dans chaque puits, et le milieu (RPMI ou DMEM, par exemple) peut contenir jusqu'à 10 % de sérum de veau fœtal.
2. À la fin du test, ajouter 0,01 ml de solution AB (MTT) dans chaque puits. Mélanger en tapotant le bord de la plaque.
3. Incuber à 37 °C le temps que le clivage du MTT se produise. La durée optimale varie d'un test à l'autre, mais un temps d'incubation de 4 heures convient dans la plupart des cas. Une fois ce temps écoulé, le formazan, produit à partir du MTT dans les puits contenant des cellules vivantes, forme des cristaux noirs duveteux au fond du puits.
4. Ajouter 0,1 ml de solution C dans chaque puits. À l'aide d'une pipette multicanal, effectuer plusieurs pipetages successifs afin de bien mélanger. L'acide chlorhydrique (HCl) fait virer au jaune le rouge de phénol présent dans le milieu de culture tissulaire, mais cela ne perturbe pas la mesure du formazan. L'isopropanol dissout le formazan en une solution bleue homogène mesurable par absorbance.
5. Dans l'heure qui suit, mesurer l'absorbance à l'aide d'un lecteur de plaques ELISA, avec une longueur d'onde de test de 570 nm et une longueur d'onde de référence de 630 nm. Après plusieurs heures à température ambiante, il se peut que les protéines sériques commencent à précipiter en raison du traitement à l'acide-alcool. Placer les plaques au frais pour accélérer la précipitation. Si les plaques doivent attendre avant la réalisation de la mesure, les conserver à 4 °C avant d'ajouter l'acide-alcool ; les amener ensuite à température ambiante et ajouter l'acide-alcool juste avant de procéder à la lecture.
Résultats :
Le test au MTT permet habituellement de détecter 200 à 50 000 cellules d'une lignée cellulaire type, bien que la plage utile aille de 1 000 à 50 000 cellules. Ces chiffres peuvent varier selon le type de cellules. Les tests de cytotoxicité doivent être mis en place de sorte que les cellules non lysées témoins donnent un signal de 0,2 à 0,4. Les tests de prolifération doivent quant à eux donner une valeur similaire à la concentration plateau. Cela correspond à environ 20 000 à 50 000 cellules par puits pour une lignée cellulaire type.
L'absorbance est directement proportionnelle au nombre de cellules ; en conditions réelles, les cellules n'absorbent pas beaucoup le rayonnement, même jusqu'à des concentrations de 1 × 106 cellules/ml.
Informations légales
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
Mention d'avertissement
Warning
Mentions de danger
Conseils de prudence
Classification des risques
Eye Irrit. 2 - Muta. 2 - Skin Irrit. 2 - STOT SE 3
Organes cibles
Respiratory system
Code de la classe de stockage
11 - Combustible Solids
Classe de danger pour l'eau (WGK)
WGK 3
Point d'éclair (°F)
Not applicable
Point d'éclair (°C)
Not applicable
Certificats d'analyse (COA)
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