S7110

Kit de detección de la apoptosis in situ con fluoresceína ApopTag

The ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit detects apoptotic cells in situ by the indirect TUNEL method, utilizing an anti-digoxigenin antibody that is conjugated to a Fluorescein reporter molecule.

• Sinónimos: Kit de detección de apoptosis
• UNSPSC Code: 12161503
• NACRES: NA.84
• eCl@ss: 32161000
• Technique(s): flow cytometry: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunohistochemistry (formalin-fixed, paraffin-embedded sections): suitable
• Detection method: fluorometric
• Shipped in: dry ice

Propiedades

• Quality Segment: 100
• manufacturer/tradename: ApopTag, Chemicon^®
• technique(s): flow cytometry: suitable, immunocytochemistry: suitable, immunohistochemistry (formalin-fixed, paraffin-embedded sections): suitable
• detection method: fluorometric
• shipped in: dry ice

Descripción

General description

El kit ApopTag de detección in situ de la apoptosis con fluoresceína detecta las células apoptóticas in situ mediante el método TUNEL indirecto, utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina que está conjugado con una molécula reportera de fluoresceína. Proporciona tinción inmunofluorescente indirecta para 40 muestras. Los resultados se analizan mediante citometría de flujo o microscopia de fluorescencia.

El kit de detección in situ de la apoptosis ApopTag con fluoresceína se ha probado para tinción específica en los siguientes sistemas modelos: (a) linfocitos de sangre periférica humana sana inducidos con dexametasona teñidos en citoespines, (b) glándula mamaria regresiva de rata teñida en cortes incluidos en parafina y fijados en formol, y (c) linfocitos de sangre periférica leucémica humana inducidos con camptotecina, teñidos en suspensiones celulares y utilizados para citometría de flujo cuantitativo.

Application

El kit ApopTag, de detección in situ de la apoptosis con fluoresceína detecta las células apoptóticas in situ mediante el método TUNEL indirecto, utilizando un anticuerpo anti-digoxigenina que se conjuga con una molécula reportera de fluoresceína.

INTRODUCCIÓN

Los kits de detección de la apoptosis in situ ApopTag marcan las células apoptóticas de las muestras experimentales modificando el ADN genómico por medio de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) con el fin de detectar las células positivas mediante tinción específica. Este manual contiene información y protocolos para el kit de detección de la apoptosis in situ ApopTag más fluoresceína (número de referencia S7110).

Principios del procedimiento

Los reactivos suministrados en todos los kits ApopTag están diseñados para marcar in situ los extremos 3′OH libres del ADN con nucleótidos marcados químicamente y no marcados. Los nucleótidos contenidos en el tampón de reacción se añaden enzimáticamente al ADN por medio de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) (13, 31). La TdT cataliza la adición de trifosfatos de nucleótidos sin necesidad de plantilla a los extremos 3′-OH del ADN bicatenario o monocatenario. Los nucleótidos incorporados forman un oligómero compuesto por el nucleótido de digoxigenina y un nucleótido sin marcar en una secuencia aleatoria. En los kits ApopTag se ha optimizado la relación nucleótido marcado a no marcado para promover la unión del anticuerpo anti-digoxigenina o para minimizar la autoatenuación de la fluoresceína. No se ha medido la longitud exacta del oligómero añadido.

A continuación se deja que los fragmentos de ADN que han sido marcados con el nucleótido de digoxigenina se unan a un anticuerpo anti-digoxigenina que se ha conjugado con fluoresceína (Figura 1A). Los anticuerpos fluorescentes proporcionan una detección sensible en inmunohistoquímica o inmunocitoquímica (es decir, en tejidos o células) y no están sujetos a variaciones experimentales debido al sustrato o a la etapa del desarrollo. Este sistema mixto biológico molecular -histoquímico permite la tinción sensible y específica de concentraciones muy elevadas de extremos de 3′-OH que estén situados en cuerpos apoptóticos. El sistema ApopTag difiere significativamente de las técnicas de etiquetado in situ descritas antes para la apoptosis (13, 16, 38, 46), en las que la unión de avidina a la biotina celular puede ser una fuente de error. Se ha observado que el sistema digoxigenina/anti-digoxigenina es igual de sensible que los sistemas de avidina/biotina (22). Los ligandos inmunoquímicamente similares para la unión del anticuerpo anti-digoxigenina son generalmente despreciables en los tejidos animales, lo que garantiza una tinción de fondo baja. El anticuerpo policlonal de oveja purificado por afinidad es el reactivo anti-digoxigenina específico utilizado en los kits ApopTag y presenta una reactividad cruzada de <1 % con los principales esteroides de vertebrados. Además, se ha eliminado la porción Fc de este anticuerpo mediante digestión proteolítica para eliminar cualquier adsorción inespecífica a los receptores celulares de Fc.

Preparation Note

1. Guardar el kit entre -15°C y -25°C hasta el primer uso. Después de la primera utilización, si el kit va a ser utilizado en los siguientes tres meses, guardar la enzima TdT (nº 90418) entre -15°C y -25°C y el resto de los componentes entre 2°C y 8°C.

2. Proteja el anticuerpo anti-digoxigenina fluoresceína (#90426) de la exposición innecesaria a la luz.

Precauciones

1. Los siguientes componentes del kit contienen cacodilato (ácido dimetilarsínico) de potasio como tampón: Tampón equilibrador (nº 90416), tampón de reacción (nº 90417) y enzima TdT (nº 90418). Estos componentes son nocivos en caso de ingestión; evítese el contacto con los ojos y la piel (utilización de guantes y gafas) y lávense de inmediato las zonas de contacto.

2. Los conjugados de anticuerpo (nº 90426) y las disoluciones de bloqueo (nº 90425) contienen azida sódica al 0,08 % como conservante.

3. La enzima TdT (nº 90418) contiene glicerol y no se congelará a -20°C. Para una máxima vida útil, no caliente este reactivo a temperatura ambiente antes de su dispensación.

Other Notes

Tampón de equilibrado 90416 3,0 ml de -15°C a -25°C

Tampón de reacción 90417 2,0 ml de -15°C a -25°C

Enzima TdT 90418 0,64 ml de -15°C a -25°C

Tampón de parada/lavado 90419 20 ml de -15°C a -25°C

Disolución de bloqueo 90425 2,6 ml de -15°C a -25°C.

Anti-digoxigenina-fluoresceína* 90426 2,1 ml de 2°C a 8°C

Cubreobjetos de plástico 90421 100 cada uno. Temp. ambiente

*anticuerpo policlonal de oveja purificado por afinidad

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CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

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Información de seguridad

• Pictogramas: GHS08,GHS09
• Palabra de advertencia: Danger
• Órganos diana: Respiratory Tract
• Clase de almacenamiento: 6.1C - Combustible acute toxic Cat.3 / toxic compounds or compounds which causing chronic effects
• ¿Qué está pasando?: WGK 3
• Códigos de peligro: H350,H373,H411,EUH430
• Indicaciones de precaución: P201 - P202 - P273 - P308 + P313 - P391 - P405 - P501
• Hazard Classifications: Aquatic Chronic 2 - Carc. 1B - ED ENV 1 - STOT RE 2 Inhalation