Criblage de génomique fonctionnelle
La génomique fonctionnelle permet de découvrir la fonction d'un gène ainsi que son implication dans les voies biochimiques, cellulaires et physiologiques. La disponibilité de séquences génomiques complètes et d'outils de modification génomique facilement programmables permet d'effectuer ces analyses à l'échelle d'un génome. Le principal objectif d'un criblage génomique est de comprendre l'émergence d'un phénotype spécifique en modifiant la fonction d'un gène de façon ciblée et délibérée. Lorsque certains gènes sont supprimés ou modulés dans une cellule ou un organisme, des changements de phénotype ou de comportement peuvent être observés, directement ou indirectement, au moyen d'expériences préparées avec soin. Le criblage de génomique fonctionnelle permet de réaliser ces analyses de façon systématique et en parallèle, d'élucider des voies complexes, de comprendre des états pathologiques et de faciliter l'identification de nouvelles cibles médicamenteuses.
La génomique fonctionnelle utilise deux grandes méthodes pour établir un lien entre génétique et phénotype. Le criblage génétique classique consiste à modifier de nombreux gènes, à sélectionner les cellules ou les organismes présentant le phénotype d'intérêt, puis à identifier les gènes dont la modulation a déclenché le changement de phénotype. Le criblage génétique inverse analyse le phénotype des cellules ou des organismes après la perturbation d'un gène ou d'une combinaison de gènes spécifique.
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Les progrès accomplis dans les technologies d'édition génomique, d'extinction de gènes, de modulation génique, de séquençage de nouvelle génération et de criblage phénotypique permettent la bonne exécution de criblages de génomique fonctionnelle sur une grande diversité de systèmes modèles.
- Interférence par ARN (ARNi) : Plusieurs types de réactifs ARNi peuvent être employés pour l'extinction (ou silençage) des gènes, notamment de longs ARN double brin (ARNdb), de petits ARN synthétiques interférents (ARNsi) et de petits ARN en épingle à cheveux (shARN). Ces réactifs ARNi sont introduits dans les cellules par transfection directe du facteur de modulation (ARNsi et ARNdb), par transfection d'un ADN codant un shARN contrôlé par un promoteur, ou par des méthodes de transduction virale utilisant des vecteurs lentiviraux contenant des cassettes de shARN clonées. L'ARNdb et l'ARNsi peuvent être utilisés sur des cribles en jeu ordonné pour un criblage à haut débit, tandis que les shARN peuvent être introduits dans des populations de cellules sur des cribles à échantillons regroupés ou en jeu ordonné pour une analyse à haut débit, les cribles à échantillons regroupés utilisant le séquençage de nouvelle génération pour la déconvolution.
- Systèmes CRISPR/Cas : Les systèmes CRISPR ("Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat", courtes répétitions palindromiques groupées et régulièrement espacées) peuvent être utilisés pour manipuler les génomes, transcriptomes et épigénomes de cellules de mammifères. Dans l'édition génomique CRISPR/Cas9, une nucléase Cas9 cible un locus spécifique par l'intermédiaire d'un ARN guide. Selon la variante de Cas9 employée, CRISPR peut servir à éteindre (ou "silencer") génétiquement la production de transcrits en introduisant des mutations par décalage du cadre de lecture, en réprimant la machinerie de transcription, en recrutant des facteurs de transcription pour activer l'expression, en induisant des mutations ponctuelles ciblées ou en modifiant les marqueurs épigénétiques. Tout comme l'ARNi, CRISPR peut être introduit directement sous forme de complexe ribonucléoprotéique (RNP) dans des cribles en jeu ordonné ou sous forme d'ADN plasmidique ou de lentivirus pour des applications de criblage à échantillons regroupés ou en jeu ordonné. Les banques, regroupements ("pools") et jeux ordonnés CRISPR permettent un criblage génétique à haut débit extrêmement polyvalent pour l'analyse fonctionnelle. Un criblage de modulation génomique est également envisageable avec un système CRISPR sans nucléase qui utilise une enzyme dCas9 inactive associée à des effecteurs transcriptionnels qui activent (CRISPRa) ou inhibent (CRISPRi) la transcription génique, entraînant une augmentation ou une diminution de l'expression des gènes.
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