Funktionsweise des Proximity Ligation Assays (PLA)
Duolink®-Proximity-Ligation-Assay
Der Duolink®-Proximity-Ligation-Assay (PLA) ist ein leistungsfähiges Instrument, das den In-situ-Nachweis von endogenen Proteinen, Proteinmodifikationen und Proteininteraktionen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit ermöglicht. Proteinziele lassen sich in unveränderten Zellen und Geweben leicht nachweisen und mit Einzelmolekülauflösung lokalisieren. In der Regel werden zwei primäre Antikörper, die in verschiedenen Spezies gezüchtet wurden, verwendet, um zwei eindeutige Proteintargets nachzuweisen (Abbildung 1A). Ein Paar Oligonukleotid-markierter Sekundärantikörper (PLA-Sonden) bindet dann an die Primärantikörper (Abbildung 1B). Danach verbinden hybridisierende Adapter-Oligos die PLA-Sonden nur dann, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, und die Ligase bildet ein geschlossenes, zirkuläres DNA-Template, das für die Rolling-Circle-Amplifikation (RCA) erforderlich ist (Abbildung 1C). Die PLA-Sonde dient dann als Primer für eine DNA-Polymerase, die während der RCA konkatemerische Sequenzen erzeugt (Abbildung 1D). Dies ermöglicht eine bis zu 1000-fache Verstärkung des Signals, das immer noch an die PLA-Sonde gebunden ist, wodurch die Lokalisierung des Signals möglich wird. Schließlich hybridisieren die markierten Oligos mit den komplementären Sequenzen innerhalb des Amplikons (Abbildung 1E), die anschließend als separate Spots (PLA-Signale) durch mikroskopische Bildanalyse sichtbar gemacht und quantifiziert werden (Abbildung 1F). Duolink® PLA kann an adhärenten Zellen, Cytospin-Präparaten und Gewebeschnitten auf Glasobjektträgern mittels Immunfluoreszenz (d. h. grünem, rotem, tiefrotem oder orangefarbenem Nachweis) oder Immunhistochemie (d. h. Peroxidase-katalysierter Reaktion) durchgeführt werden. Darüber hinaus kann Duolink® PLA an Blut- oder Suspensionszellen zum Nachweis mittels Durchflusszytometrie durchgeführt und in Multi-Well-Platten (z. B. 96- oder 384-Well) mit einem High-Content-Screening-Imager für die Hochdurchsatzanalyse verwendet werden. Die hohe Spezifität, Sensitivität und Vielseitigkeit von Duolink®-PLA machen es zu einer idealen Methode für die Pathwayanalyse, die Kinetik von Wirkstoff-Screens, die Bestimmung von IC50 und die Targetvalidierung.
Abbildung 1. Schematische Darstellung einer Duolink® PLA Reaktion.A) Zwei primäre Antikörper erkennen (ein) spezifische(s) Protein(e) von Interesse in der Zelle. Die gelben und grünen Kügelchen stellen zwei Epitope eines einzelnen Proteins oder Epitope auf zwei verschiedenen Proteinen dar, die miteinander interagieren. (B) Mit Oligonukleotiden gekoppelte sekundäre Antikörper (PLA-Sonden) binden an die primären Antikörper. (C) Wenn sich die PLA-Sonden in unmittelbarer Nähe befinden, verbinden sich die Adapter-Oligos mit den PLA-Sonden und werden ligiert. (D) Das entstandene geschlossene, zirkuläre DNA-Template wird durch die DNA-Polymerase amplifiziert. (E) An Fluorochrome gekoppelte komplementäre Oligos für den Nachweis hybridisieren an sich wiederholende Sequenzen in den Amplikons. (F) PLA-Signale werden durch Fluoreszenzmikroskopie als separate Flecken erkannt und geben Aufschluss über die intrazelluläre Lokalisierung des Proteins oder der Proteininteraktion.
Nachweis der Dimerisierung von EGFR und HER2 mit dem Duolink® Proximity Ligation Assay
Die Dimerisierung des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR, ErbB1, HER1) und des humanen epidermalen Rezeptors 2 (HER2, ErbB2, Neu) ist eine bekannte Protein-Protein-Interaktion (PPI). EGFR und HER2 gehören zur ErbB-Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von Zellteilung und Zelltod spielen. Mutationen, die die Expression oder Aktivität eines dieser Proteine beeinträchtigen, werden mit der Entwicklung einer Vielzahl von Krebsarten in Verbindung gebracht. Nach Bindung eines Liganden (z. B. EGF) an die extrazelluläre Domäne des EGFR wird der Rezeptor aktiviert und autophosphoryliert seinen zytoplasmatischen Schwanz. Dies führt zur Bildung von Homo- (EGFR-EGFR) und Heterodimeren (z. B. EGFR-HER2) mit anderen Mitgliedern der ErbB-Familie (Abbildung 2). Dimerisierung und anschließende Phosphorylierung führen zur Rekrutierung von Adaptorproteinen, zur Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden und schließlich zu Veränderungen in der Gentranskription, die zu Proliferation, Angiogenese, Invasion, Metastasierung und verminderter Apoptose von Krebszellen führen können.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der EGFR-HER2-Dimerisierung.Liganden wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) binden an die extrazelluläre Domäne des EGFR, was zur Aktivierung und Autophosphorylierung führt. Dies wiederum führt zu einer EGFR-Homodimerisierung (nicht abgebildet) oder Heterodimerisierung mit anderen Mitgliedern der ErbB-Familie, wie z. B. HER2. Die Dimerisierung und die anschließende Phosphorylierung führen zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen. Bildquelle: Lancet Oncol. 16(15):e543-e554
Durch Duolink® PLA Control Kit – PPI wird bestätigt, dass Ihr Versuch funktioniert
Die menschlichen Ovarialkarzinomzellen SK-OV3 weisen mäßige bis hohe EGFR- und HER2-Konzentrationen auf. Zur Bestätigung des In-situ-Nachweises der EGF-induzierten EGFR-HER2-Dimerisierung wurde das Duolink® PLA Control Kit – PPI verwendet. Jedes Kit enthält zwei 8-Well-Kammer-Objektträger mit EGF-behandelten, vorfixierten SKOV3-Zellen und primären Maus Anti-EGFR- und Kaninchen Anti-HER2-Antikörpern. Die optimalen Konzentrationen der primären Antikörper wurden bereits bestimmt, die Empfehlungen sind in der Produkt-Packungsbeilage enthalten. Nach der Rehydrierung in 1x PBS wurden die Zellen mit 0,2 % Triton X-100 in 1x PBS für 10 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert und dann eine Stunde bei 37 °C mit Duolink® PLA Blockierungspuffer blockiert. Die Zellen in Well-Duplikaten wurden dann mit beiden primären Antikörpern inkubiert. Zu den technischen Negativkontrollen gehörte die Inkubation mit jedem einzelnen primären Antikörper und die Inkubation ohne primären Antikörper, die in Well-Duplikaten durchgeführt wurden (Abbildung 3). Nach dem Waschen wurden die Duolink®-PLA gemäß dem Duolink®-PLA-Fluoreszenzprotokoll durchgeführt. Alle Wells wurden mit Duolink® Anti-Kaninchen PLUS und Anti-Maus MINUS PLA-Sonden inkubiert und die PLA-Signale wurden mit dem Duolink® In-Situ Nachweisreagenz Tiefrot erzeugt. Die Objektträger wurden mit dem Duolink® In Situ Eindeckmedium mit DAPI eingedeckt und die Bilder wurden mit dem GE IN Cell Analyzer 2200 aufgenommen.
Abbildung 3. Duolink® PLA Control Kit – PPI Objektträger-Layout und Probenplatzierung.Alle Wells enthalten EGF-stimulierte, vorfixierte SK-OV3-Zellen. Nach der Permeabilisierung und Blockierung wurden die Wells 1 und 5 sowohl mit Kaninchen Anti-EGFR- als auch mit Maus Anti-HER2-Primärantikörpern, die Wells 2 und 6 nur mit Anti-EGFR-Antikörpern, die Wells 3 und 7 nur mit Anti-HER2-Antikörpern und die Wells 4 und 8 nur mit Antikörperverdünnungsmittel inkubiert.
Ähnliche PLA-Ergebnisse wurden erzielt, wenn die primären Antikörper zwei Stunden bei 37 °C (Abbildung 4A-4D) oder über Nacht bei 4 °C (Abbildung 4E-4H) inkubiert wurden, wodurch der Anwender mehr Flexibilität erhält. Ein robustes PLA-Signal wurde in EGF-aktivierten SK-OV3-Zellen nachgewiesen, wenn sowohl Anti-EGFR- als auch Anti-HER2-Primärantikörper vorhanden waren, was auf reichlich vorhandene EGFR:HER2-Komplexe hindeutet (Abbildung 4A, 4E). Trotz einheitlicher Behandlung der SK-OV3-Zellen mit EGF variierte die Anzahl der PLA-Signale/EGFR:HER2-Komplexe zwischen den Zellen. Dies ist wahrscheinlich auf die unterschiedliche Expression von HER2 innerhalb der SK-OV3-Zellpopulation zurückzuführen (Daten nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu wurden nur sehr wenige PLA-Signale festgestellt, wenn nur ein primärer Antikörper verwendet wurde oder wenn beide primären Antikörper weggelassen wurden (Abbildung 4B-D, 4F-H). Zu hohe Konzentrationen von primären Antikörpern können zu einer erhöhten Anzahl von PLA-Signalen führen, wenn sie separat verwendet werden, und/oder zu einer Koaleszenz positiver PLA-Signale führen, die nicht genau quantifiziert werden können (Daten nicht dargestellt). Daher ist es wichtig, die empfohlenen Konzentrationen der primären Antikörper zu verwenden. Insgesamt zeigen diese Daten, dass EGFR:HER2-Komplexe in EGF-stimulierten SK-OV3-Zellen mit dem Duolink® PLA Control Kit – PPI nachgewiesen und quantifiziert werden können.
Abbildung 4. Nachweis der EGF-induzierten EGFR:HER2-Dimerisierung mit Duolink® PLA.Objektträger mit EGF-behandelten, fixierten SK-OV3-Zellen wurden mit Maus Anti-EGFR- und Kaninchen Anti-HER2-Antikörpern (A, E), nur mit Anti-EGFR-Antikörpern (B, F), nur mit Anti-HER2-Antikörpern (C, G) oder nur mit Antikörperverdünnungsmittel (D, H) für zwei Stunden bei 37 °C (A-D) oder über Nacht bei 4 °C (E-H) inkubiert. Duolink® PLA wurden dann mit Anti-Kaninchen PLUS und Anti-Maus MINUS PLA-Sonden durchgeführt. Pro Well wurden zehn zufällige 20x Bilder mit den Filtern DAPI (blaue Zellkerne) und Cy5 (rote PLA-Signale) aufgenommen. Die Bilder sind repräsentativ aus mindestens 5 unabhängigen Versuchen.
Protein-Nachweisformate für Duolink® PLA Produkte
Duolink® PLA Produkte sind für Fluoreszenz und Hellfeld erhältlich. Fluoreszenz Duolink®-PLA-Reagenzien können gegenwärtig sowohl in der Mikroskopie als auch in der Durchflusszytometrie eingesetzt werden.
Fluoreszenznachweis
Die Fluoreszenzmikroskopie ist das am häufigsten eingesetzte Anwendungsformat für Duolink®-PLA-Experimente. Ein Großteil des Protokolls ist unter Einsatz von Fluorescence-Duolink®-PLA -Reagenzien identisch mit dem der herkömmlichen Immunfluoreszenz (IF), jedoch weist die Duolink®-PLA -Technologie eine größere Spezifität und Vielseitigkeit auf als IF. Der zusätzliche Amplifikationsschritt im Duolink®-PLA-Verfahren vermittelt eine höhere Empfindlichkeit.
Hellfeldnachweis
Wie bei der traditionellen Immunhistochemie (IHC) wird Brightfield-Duolink®-PLA vor allem bei formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten eingesetzt, sie ist aber auch mit anderen Probentypen kompatibel. Hellfeld Duolink® PLA Nachweisreagenzien enthalten mit Meerrettichperoxidase (HRP) markierte Oligonukleotide, die in Gegenwart eines HRP-Substrats einen Enzym-Substrat-Niederschlag bilden, der unter einem Lichtmikroskop sichtbar wird.
Durchflusszytometrie
Das Duolink® Flow PLA Kit ist ein schnelles, leistungsstarkes Werkzeug für die statistische Analyse. Mit diesen Kits werden Protein-Protein-Interaktionen oder die subzelluläre Lokalisierung identifiziert. Die Kombination aus Duolink® PLA und Durchflusszytometrie ermöglicht die Erfassung quantitativer Daten im Hochdurchsatzverfahren.
Der Einstieg in die Duolink® PLA Technologie
Das Duolink®-PLA-Starter-Kit enthält alle notwendigen Reagenzien, die Sie für die Durchführung von Duolink®-PLA-Experimenten und die Analyse von bis zu 30 Proben benötigen. Alles, was Sie zur Verfügung stellen müssen, sind vorbereitete Zellen oder Gewebeproben, primäre Antikörper und eine übliche Laborausrüstung.
Ein Duolink® PLA Starter-Kit enthält:
- Zwei PLA-Sonden: eine PLUS- und eine MINUS-Sonde (abgestimmt auf den Wirt der primären Antikörper)
- Antikörper-Verdünnungsmittel und Blockierungspuffer
- Nachweisreagenz: wahlweise rot oder orange
- Amplifikationspuffer und Polymeraseenzym
- Ligationslösung und Ligaseenzym
- Waschpuffer A und B
- Eindeckmedium mit DAPI
Zusätzlich zu den Duolink® PLA Protokollen für Fluoreszenz-, Hellfeld und Durchflusszytometrie finden Sie in unserem Informationszentrum weitere Informationen zur erfolgreichen Einrichtung und Durchführung eines Duolink® PLA Versuchs:
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