Markierungsmethoden mit Digoxigenin (DIG)

• Digoxigeninmarkierung (DIG-Markierung) und Anti-DIG-Antikörper
• DIG-DNA-Markierung durch PCR
• DIG Random-primed DNA-Markierung
• Nick-Translationsmarkierung von dsDNA für In-situ-Sonden
• Transkriptionsmarkierung von RNA-Sonden
• DIG 5‘-Endmarkierung, 3‘-Endmarkierung und 3‘-Schwanzmarkierung von Oligonukleotiden
• Bewertung der Sondenausbeute durch direktes Nachweisverfahren
• Downloads und Informationen zu DIG

Digoxigeninmarkierung (DIG-Markierung) und Anti-DIG-Antikörper

Das DIG-System ist die nichtradioaktive Technologie der Wahl für die Markierung und den Nachweis von Nukleinsäuren für mehrere Anwendungen. Das System basiert auf einem Steroid, das aus Fingerhutpflanzen (Digitalis purpurea und Digitalis lanata) isoliert wird. Diese Pflanzen sind die einzige natürliche Quelle von Digoxigenin. Der Anti-DIG-Antikörper bindet also nicht an anderes biologisches Material, wodurch eine spezifische Markierung sichergestellt wird. Aufgrund dieser hohen Spezifität wird im Vergleich zur radioaktiven Markierung weniger Material benötigt, wodurch das DIG-System ideal für die Nukleinsäurehybridisierungsanalyse ist. Immobilisierte Nukleinsäuren werden mit einer mit DIG markierten Sonde hybridisiert. Der anschließende Nachweis erfolgt mit hochaffinen Anti-Digoxigenin-Antikörpern, die für den colorimetrischen, chemilumineszenten oder fluoreszenten Nachweis entweder an alkalische Phosphatase (AP), Meerrettichperoxidase (HRP), Fluorescein oder Rhodamin gekoppelt werden.

Abbildung 1. Beispiel für den Nachweis von mit DIG markierten Nukleinsäuren bei Verwendung von Chemilumineszenzsubstraten.

DIG-DNA-Markierung durch PCR

Die PCR-Markierung ist das bevorzugte Verfahren für die Herstellung von mit DIG markierten Sonden, wenn das Template nur in begrenzten Mengen verfügbar, teilweise aufgereinigt oder sehr kurz ist. Sie erfordert weniger Optimierung als andere Verfahren und erzeugt hohe Ausbeuten markierter Sonden. Bei der PCR-Markierung integriert eine thermostabile Polymerase DIG-dUTP, während sie einen bestimmten Bereich der Template-DNA amplifiziert. Dadurch wird eine hochgradig markierte, spezifische und besonders empfindliche Hybridisierungssonde erzeugt.

Reaktionsprinzip

Im Verlauf einer Standard-PCR-Reaktion wird Digoxigenin-11-dUTP in neu synthetisierte DNA integriert. Die einzige Voraussetzung ist, dass eine Sequenzinformation der Zielsequenz benötigt wird, um die geeigneten Primer zu synthetisieren. Im nichtradioaktiven DIG-System wird Digoxigenin eingesetzt, ein Steroid-Hapten, um DNA, RNA oder Oligonukleotide für die Hybridisierung zu markieren sowie für den anschließen Farb- oder Lumineszenznachweis. Das Digoxigenin wird durch eine alkalilabile Esterbindung an dUTP gebunden. Das markierte dUTP kann leicht durch eine enzymatische Nukleinsäuresynthese mit DNA-Polymerasen integriert werden. Die Kombination aus nichtradioaktiver Markierung und PCR ist ein leistungsstarkes Instrument für die Analyse von PCR-Produkten und die Herstellung von markierten Sonden für kleine Mengen einer entsprechenden Zielsequenz.

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung		Andere Markierungsreagenzien
PCR-Markierung	Kits für die Markierung	PCR DIG Probe Synthesis Kit PCR ELISA, DIG-Markierung
	Mischungen für die Markierung ohne Enzyme	PCR DIG Labeling Mix PCR DIG Labeling MixPLUS
	Nukleotide für die Markierung	Digoxigenin-11-dUTP, alkalibeständig Digoxigenin-11-dUTP, alkalilabil Desoxynucleosid-Triphosphat-Set	Fluorescein-12-dUTP Tetramethyl-Rhodamin-5-dUTP
	Enzyme	Expand High FidelityPLUS PCR-System	Expand High FidelityPLUS PCR-System

Eigenschaften und Vorteile der DIG-DNA-Markierung durch PCR

PCR-Bedingungen

• Optimieren Sie die PCR-Amplifikationsparameter (Zyklusbedingungen, Template-Konzentration, Primersequenz und Primerkonzentration) für jedes Set aus Template und Primer in Abwesenheit von DIGdUTP, bevor Sie die Integration von DIG durchführen.

Template

• Verwenden Sie klonierte Inserts als Template, um das beste Ergebnis zu erhalten. Genomische DNA kann schwieriger zu verwenden sein.
• Die Template-Konzentration ist für eine erfolgreiche Herstellung spezifischer Sonden von größter Bedeutung.

Markieren

Das DIG Probe Synthesis Kit erfordert weniger Optimierung als die meisten Markierungsmethoden, da es eine Expand High Fidelity-Enzymmischung enthält. Die Vorteile dieser Enzymmischung sind unter anderem:

• Sie kann GC-reiche Regionen effizient als Template verwenden
• Bei den meisten Templates erfordert sie keine Optimierung der MgCl₂-Konzentration und Markierungsreaktionen funktionieren mit der Standardkonzentration von 1,5 mM MgCl₂

DIG Random-primed DNA-Markierung

Das Verfahren der „Random-primed“ DNA-Markierung basiert auf der Hybridisierung einer Mischung aller möglichen Hexanukleotide an das DNA-Template. Alle Sequenzkombinationen sind in der Hexanukleotid-Primermischung vertreten, was zu einer statistischen Bindung des Primers an die Template-DNA führt. Somit wird ein gleichbleibendes Markierungsmaß entlang der gesamten Länge der Template-DNA garantiert. Der komplementäre Strang wird vom 3‘-OH-Terminus des zufälligen Hexanukleotidprimers mit Klenow-Enzym in Markierungsqualität synthetisiert. Modifizierte Desoxyribonukleosidtriphosphate ([32P]-, [35S]-, [3H]-, [125I]-, Digoxigenin- oder Biotin-markiert) in der Reaktion werden in den neu synthetisierten komplementären DNA-Strang integriert.

Diese markierten Sonden eignen sich besonders für den Nachweis von Einzelkopien von Genen auf genomischen Southern Blots, beim Screening rekombinanter Bibliotheken, Dot/Slot-Blots und Northern Blots. Da jeder Primer eine andere Sequenz aus sechs Basen aufweist, wird das markierte Sondenprodukt eine Sammlung aus Fragmenten mit variabler Länge sein. Somit erscheint die markierte Sonde als Schmierspur und nicht als eindeutige Bande auf einem Gel. Die Größenverteilung der markierten Sonde ist von der Länge des Original-Templates abhängig.

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung		Andere Markierungsreagenzien
Random Priming	Kits für Markierung und Nachweis	DIG-High Prime DNA-Markierungs- und Detektions-Starterkit I DIG-High Prime DNA-Markierungs- und Detektions-Starterkit II DIG DNA-Markierungs- und Detektionskit
	Kits für die Markierung	DIG DNA Labeling Kit	Random Primed DNA Labeling Kit
	Mischungen für die Markierung ohne Enzyme	DIG-High Prime DIG DNA-Markierungsmix	High Prime Biotin-High Prime Fluorescein-High Prime
	Nukleotide für die Markierung	Digoxigenin-11-dUTP, alkalibeständig Digoxigenin-11-dUTP, alkalilabil	Hexanukleotid-Gemisch Biotin-16-dUTP Fluorescein-12-dUTP Tetramethyl-Rhodamine-5-dUTP
	Enzyme	Klenow-Enzym, Markierungsqualität	Klenow-Enzym, Markierungsqualität
	Zusätzliche Produkte	Primer “random”	Primer “random”

Reaktionsprinzip

Bei der Random-primed-Markierung kopiert das Klenow-Enzym das DNA-Template in Gegenwart von Hexamerprimern und alkalilabilem DIG-11-dUTP. Durchschnittlich integriert das Enzym eine DIG-Einheit in jeden Abschnitt aus 20–25 Nukleotiden. Das resultierende markierte Produkt ist eine homogen markierte, sensitive Hybridisierungssonde, mit der schon 0,10–0,03 pg der Ziel-DNA nachgewiesen werden können.

Nick-Translationsmarkierung von dsDNA für In-situ-Sonden

Das Nick Translationsverfahren basiert auf der Fähigkeit der DNase I, bei geringen Enzymkonzentrationen in Gegenwart von Mg2+ zufällig verteilte Nicks in DNA zu integrieren. E. coli-DNA-Polymerase I synthetisiert DNA komplementär zum intakten Strang in 5‘-3‘-Richtung unter Verwendung der 3‘-OH-Enden des Nicks als Primer. Durch die 5‘-3‘-exonukleolytische Aktivität von DNA-Polymerase I werden gleichzeitig Nukleotide in Syntheserichtung entfernt. Die Polymeraseaktivität ersetzt sequentiell die entfernten Nukleotide durch isotopenmarkierte oder haptenmarkierte Desoxyribonukleosidtriphosphate. Bei niedrigen Temperaturen (+15 °C) wird damit die unmarkierte DNA während der Reaktion durch neu synthetisierte, markierte DNA ersetzt. Für In-situ-Hybridisierungsverfahren soll die Länge der aus diesem Verfahren erhaltenen markierten Fragmente etwa 200–500 Basen betragen.

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung		Andere Markierungsreagenzien
Nick-Translation	Kits für die Markierung		Nick Translation Kit
	Mischungen für die Markierung ohne Enzyme	DIG-Nick Translationsmischung	Nick Translation Mix Biotin-Nick Translation Mix
	Nukleotide für die Markierung	Digoxigenin-11-dUTP, alkalibeständig Digoxigenin-11-dUTP, alkalilabil Desoxynucleosid-Triphosphat-Set
	Enzyme	DNA-Polymerase I DNase I, rekombinant, RNase-frei	DNA-Polymerase I DNase I, rekombinant, RNase-frei

Transkriptionsmarkierung von RNA-Sonden

Für einige Anwendungen ist die DIG-markierte RNA eine wirksamere Hybridisierungssonde als DIG-markierte DNA. Durch DIG-markierte RNA-Sonden können zum Beispiel seltene mRNA in Nanogrammmengen von Gesamt-RNA nachgewiesen werden. Diese markierten RNA-Sonden werden durch die In-vitro-Transkription eines DNA-Templates erzeugt. Beim RNA-Transkriptionsverfahren wird die DNA in die multiple Klonierungsstelle eines Transkriptionsvektors zwischen Promotern für verschiedene RNA-Polymerasen (wie T7-, SP6- oder T3-RNA-Polymerase) kloniert. Das Template wird anschließend durch Spaltung des Vektors an einer eindeutigen Stelle (in der Nähe des Inserts) linearisiert. Eine RNA-Polymerase transkribiert die Insert-DNA in Gegenwart einer Mischung aus Ribonukleotiden (einschließlich DIG-UTP) in eine Antisense-RNA-Kopie. Während der Reaktion kann die DNA viele Male transkribiert werden (bis zu hundertfach), um eine große Menge DIG-markierter RNA-Kopien mit voller Länge zu erzeugen (10–20 µg RNA aus 1 µg DNA in einer Standardreaktion). DIG wird im Abstand von etwa 25–30 Nukleotiden in die RNA integriert.

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung		Andere Markierungsreagenzien
In-vitro-Transkription	Kits für die Markierung	DIG Northern-Starterkit DIG RNA-Markierungskit (SP6/T7)	SP6/T7 Transcription Kit
	Mischungen für die Markierung ohne Enzyme	DIG RNA-Markierungsmix	Biotin RNA Labeling Mix Fluorescein RNA Labeling Mix
	Nukleotide für die Markierung	Digoxigenin-11-UTP	Biotin-16-UTP Fluorescein-12-UTP Biotin-11-CTP
	Enzyme	SP6-RNA-Polymerase T3-RNA-Polymerase T7-RNA-Polymerase	SP6-RNA-Polymerase T3-RNA-Polymerase T7-RNA-Polymerase
	Zusätzliche Produkte	Protector RNase-Inhibitor	Protector RNase-Inhibitor

Reaktionsprinzip

Das zu transkribierende DNA-Template wird in die Polylinker-Stelle eines geeigneten Transkriptionsvektors kloniert, der Promoter für SP6- und/oder T3- und T7-RNA-Polymerasen enthält. Nach der Linearisierung an einer geeigneten Stelle wird RNA in Gegenwart von DIG-11-UTP transkribiert. Unter Standardbedingungen werden etwa 10 µg DIG-markierte Volllängen-RNA aus 1 µg Template transkribiert.

Die folgenden Hinweise sind wichtig für eine erfolgreiche RNA-Sondenmarkierung:

RNasen

RNasen kommen überall vor und erfordern für die Aktivität keine Cofaktoren. Um erfolgreich zu sein, müssen alle möglichen Vorkehrungen getroffen werden, um eine RNase-Kontamination zu verhindern. Zum Beispiel:

• Es wird empfohlen, Einwegartikel aus Kunststoff, ofenfestes Laborglas oder Artikel aus Kunststoff zu verwenden, die mit RNase-ZAP oder ähnlichen Reagenzien dekontaminiert wurden.
• Stellen Sie alle Lösungen mit Wasser her, das mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) oder Dimethyldicarbonat (DMDC) behandelt wurde und autoklavieren Sie die Lösungen.
• Tragen Sie während des gesamten Verfahrens Handschuhe.
• Die Markierungseffizienz hängt in hohem Maß von der Reinheit des DNA-Templates ab. Das Template soll hochgradig aufgereinigt sein.
• Das endgültige Template muss linearisiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt sein.

Template-Sequenz

• Einige Primer- und/oder Polylinker-Regionen in den DNA-Templates sind homolog zu Abschnitten der ribosomalen 28S- und 18S-RNA-Sequenzen. Daher können die markierten Sonden in Proben, die diese auffälligen RNA enthalten, spezifische, aber unerwünschte Signale erzeugen. Entfernen Sie so viele der Polylinker-Sequenzen wie möglich aus dem Template, um diesen Effekt zu minimieren.
• Falls Sie PCR verwenden, um das DNA-Template herzustellen, enthält das Produkt der Expand High Fidelity-Reaktion einige Fragmente mit einem einzelnen 3‘-A-Überhang. Dieser Überhang kann in der Transkriptionsmarkierungsreaktion umhüllende Produkte erzeugen.

Template-Länge

• Die optimale Template-Länge beträgt etwa 1 kb
• Die minimale Länge soll mindestens 200 bp betragen

Lagerung der Sonde

• Damit eine lange Haltbarkeit erreicht wird, sollen RNA-Sonden aliquotiert und bei -20 °C oder -70 °C gelagert werden.
• DIG-markierte RNA-Sonden sind in Ethanol bei -20 °C oder -70 °C mindestens ein Jahr haltbar.

Sondensensitivität

• Um die Sensitivität einer DIG-markierten Antisense-RNA-Sonde schnell zu bestimmen, stellen Sie die entsprechende Sense-RNA (nicht markiert) durch In-vitro-Transkription her. Verwenden Sie das aufgereinigte Sense-Transkript anschließend in verschiedenen Konzentrationen als Ziel auf einem Northern Blot. Mit dem Ergebnis des Blots kann die geringste Menge des Ziels (Sense-Transkript), die von der markierten Sonde (Antisense-Transkript) erfasst werden kann, leicht bestimmt werden.

DIG 5‘-Endmarkierung, 3‘-Endmarkierung und 3‘-Schwanzmarkierung von Oligonukleotiden

Für einige Anwendungen wie die In-situ-Hybridisierung ist ein DIG-markiertes synthetisches Oligonukleotid die beste Hybridisierungssonde. Neben In-situ-Hybridisierungen können DIG-markierte Oligonukleotide in zahlreichen Anwendungen als Hybridisierungssonden eingesetzt werden, wie z. B. Dot/Slot-Blots, Screening von Bibliotheken, Nachweis wiederholter Gensequenzen auf Southern Blots und Nachweis von abundant vorkommender mRNA auf Northern Blots.

Für die DIG-Markierung von Oligonukleotiden sind mehrere Verfahren verfügbar, die nachstehend zusammengefasst werden.

5‘-Endmarkierung von Oligonukleotiden mit DIG-NHS-Ester

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung
5‘-Endmarkierung Benötigtes Nukleotid: 100 nmol Erforderliche Zeit und Temperatur: über Nacht, +15 bis +25 °C Erfordert nur geringe Template-Mengen	Zusätzliche Produkte	Digoxigenin-3-O-methylcarbonyl- ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester

3‘-Endmarkierung von Oligonukleotiden mit DIG-ddUTP

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung		Andere Markierungsreagenzien
3‘-Endmarkierung Benötigtes Nukleotid: 100 pmol Erforderliche Zeit und Temperatur: 15 Minuten, +37 °C Kann Folgendes nachweisen: 10 pg DNA Erfordert nur geringe Template-Mengen Markierte Sonden können ohne Aufreinigung verwendet werden Die Reaktion kann unendlich hochskaliert werden, wenn die Inkubationszeit auf 1 h verlängert wird	Kits für die Markierung	DIG Oligonucleotide 3'-End Labeling Kit, 2nd Generation DIG Gel Shift Kit, 2nd generation
	Nukleotide für die Markierung	Digoxigenin-11 ddUTP	Biotin-16-ddUTP
	Enzyme	Terminale Transferase	Terminale Transferase

Anhängen eines 3‘-Schwanz aus DIG-dUTP und dATP (etwa 40–50 Reste)

Abbildung 2. Tailing und Nachweis nichtradioaktiver Oligonukleotide.

Markierungsmethoden	Reagenzien für die DIG-Markierung		Andere Markierungsreagenzien
Tailing Benötigtes Nukleotid: 100 pmol Erforderliche Zeit und Temperatur: 15 Minuten, +37 °C Kann Folgendes nachweisen: 1 pg DNA  Erfordert nur geringe Template-Mengen  Erzeugt sensitivere Sonden als die Endmarkierung Markierte Sonden können ohne Aufreinigung verwendet werden Die Reaktion kann unendlich aufskaliert werden	Nukleotide für die Markierung	Digoxigenin-11-dUTP, alkalibeständig Digoxigenin-11-dUTP, alkalilabil	Biotin-16-dUTP Fluorescein-12-UTP Tetramethyl-Rhodamine-5-dUTP
	Enzyme	Terminale Transferase	Terminale Transferase

Bewertung der Sondenausbeute durch direktes Nachweisverfahren

Um die richtige Sondenmenge zu einer Hybridisierung zuzugeben, muss zunächst die Menge der in der Markierungsreaktion hergestellten DIG-markierten Sonde bestimmt werden. Im direkten Nachweisverfahren, das in diesem Beitrag erwähnt wird, wird die Menge der DIG-Markierung in einer Reihe von Verdünnungen, die aus der markierten Sonde hergestellt wurden, mit einer bekannten Konzentration einer DIG-markierten Kontrollnukleinsäure verglichen.

Hinweis: Falls Sie eine DNA-Sonde mittels PCR markieren, muss für die Bewertung der Ausbeute kein direkter Nachweis durchgeführt werden.

Verwenden Sie für PCR-markierte Sonden das Gelelektrophorese-Bewertungsverfahren.

Der direkte Nachweis umfasst folgende Schritte:

• Herstellen von seriellen Verdünnungen markierter Sonden und Tüpfeln auf eine Nylonmembran (erforderliche Zeit: 15 Minuten)
• Nachweisen von DIG in den Tupfen mittels Chemilumineszenz, erforderliche Zeit (2–2,5 Stunden)

Downloads und Informationen zu DIG

Benötigen Sie Hilfe? Lesen Sie unseren DIG product selection guide (Leitfaden zur DIG-Produktauswahl).

Weitere Informationen finden Sie in folgenden Broschüren:

• The DIG System
• DIG System for In Situ Hybridization
• DIG System for Filter Hybridization

Detaillierte technische Informationen entnehmen Sie bitte den DIG-Handbüchern:

• DIG Application Manual for Filter Hybridization
• DIG Application Manual for Nonradioactive In Situ Hybridization, 4. Ausgabe

Lernen Sie durch unsere technischen Hinweise, wie Sie das DIG-System handhaben:

• DIG System Sensitivity and Specificity
• RNA Labeling using In Vitro Transcription

Nur für die Life-Science-Forschung. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.