Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Reagenzien und Ausstattung

1. 20x Kochsalzlösung-Natriumcitrat-Puffer (SSC: 3 M NaCl, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7, oder Produkt-Nr. S6639)
2. RNase A (Produkt-Nr. R4642) 100 µg/ml in 2x SSC
3. Pepsin (Produkt-Nr. P6887) 40 Einheiten/ml in 10 mM HCl
4. Paraformaldehyd, EM-Qualität (Produkt-Nr. P6148) frisch depolymerisiert, 4 % w/v in Wasser
5. Ethanol
6. Markierte Sonde Plasmid-DNA wird mit Biotin-11-dUTP markiert, durch Nick-Translation und Zufalls-Priming oder durch A3803(z. B., ADVANCE™ Nick Translation Kit)
7. Hybridisierungsgemischlösung: 50 % Formamid (Produkt-Nr. F7508), 10 % Dextransulfat (Produkt-Nr. D8906), 0,1 % SDS (Produkt-Nr. L4390), 0,5–1,5 ng/µl markierte Sonde und 300 ng/ml Lachssperma-DNA (Produkt-Nr. D7656) in 2x SSC
8. Waschpuffer: 20 % Formamid (Produkt-Nr. F7508) in 0,1x SSC
9. Nachweispuffer: 0,2 % Tween 20 (Produkt-Nr. P1379) in 4x SSC
10. Blockierungspuffer: 5 % Rinderalbumin (Produkt-Nr. A3803) in Nachweispuffer
11. Antikörper oder Nachweissubstanz (z. B. Streptavidin-Cy3, Produkt-Nr. S6402) in Blockierungspuffer
12. DAPI (Produkt-Nr. D9542) 2 µg/ml in Eindeckmittel mit Antibleichmittel.
13. Fluoreszenzmikroskop, Filter und optional ein Dreifach-Bandpassfilter (x58, Omega Optics)
14. Glas-Objektträger (Produkt-Nr. S8400)
15. Kunststoff-Deckgläser für die Inkubations- und Hybridisierungsschritte (aus autoklavierbaren Abfallbeuteln ausgeschnitten, z. B. Produkt-Nr. B4408)
16. Heizblock/modifizierter Thermocycler
17. Coplin-Behälter für Waschschritte (Produkt-Nr. S6016, S5641 oder S5891)

Durchführung

Präparat-Vorbereitung
Hybridisierung
Nachweis

Präparat-Vorbereitung (Objektträger)

1. Verwenden Sie Chromosomenpräparate (auf Objektträgern) aus jeglichem Zelltyp.
2. Inkubieren Sie die Präparate (Objektträger) 1 Stunde lang bei 37 °C mit 200 µl RNase.
3. Waschen Sie die Präparate 5 Minuten lang in 2x SSC. Wiederholen Sie diesen Schritt.
4. Spülen Sie die Präparate in 10 mM HCl.
5. Inkubieren Sie die Präparate 10 Minuten lang bei 37 °C mit 200 µl Pepsin.
6. Spülen Sie die Präparate in entionisiertem H₂O.
7. Waschen Sie die Präparate 5 Minuten lang in 2x SSC. Wiederholen Sie diesen Schritt.
8. Stabilisieren Sie die Präparate 10 Minuten lang in Paraformaldehyd.
9. Waschen Sie die Präparate 5 Minuten lang in 2x SSC. Wiederholen Sie diesen Schritt.
10. Entwässern Sie die Präparate in der folgenden Ethanolreihe: 70 %, 80 %, 95 %; jeweils 2 Minuten.
11. Lassen Sie die Präparate an der Luft trocknen.

Hybridisierung

1. Stellen Sie 30 µl Hybridisierungslösung pro Präparat her. Erhitzen Sie diese 10 Minuten lang auf 70 °C und legen Sie sie dann auf Eis.
2. Pipettieren Sie 30 µl Hybridisierungslösung auf jedes Präparat und bedecken Sie es mit einem Kunststoff-Deckglas.
3. Denaturieren Sie die Präparate 5 Minuten lang bei 65–70 °C auf dem Heizblock.
4. Senken Sie langsam die Temperatur auf 37 °C.
5. Hybridisieren Sie die Präparate über Nacht bei 37 °C in einer feuchten Kammer.

Nachweis

1. Waschen Sie die Präparate in 2x SSC, um die Deckgläser zu entfernen.
2. Waschen Sie die Präparate 5 Minuten lang bei 40 °C in Waschpuffer. Wiederholen Sie diesen Schritt.
3. Waschen Sie die Präparate 5–15 Minuten lang bei 40 °C in 0,1x SSC.
4. Waschen Sie die Präparate 5–15 Minuten lang bei 40 °C in 2x SSC.
5. Lassen Sie die Präparate auf Raumtemperatur abkühlen.
6. Equilibrieren Sie die Präparate 5 Minuten lang in Nachweispuffer.
7. Zum Blockieren legen Sie die Präparate 20–30 Minuten lang in Blockierungspuffer.
8. Inkubieren Sie die Präparate 30–60 Minuten lang mit 50 µl Antikörper oder Nachweissubstanz (z. B. 5 µg/ml Streptavidin-Cy3 in Blockierungspuffer).
9. Waschen Sie die Präparate 5 Minuten lang in 2x SSC. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei Mal.
10. Führen Sie die Gegenfärbung 10 Minuten lang mit DAPI-Lösung durch.
11. Spülen Sie die Präparate kurz und bedecken Sie sie mit Eindeckmittel mit Antibleichmittel.
12. Analysieren Sie die Präparate unter dem Fluoreszenzmikroskop.
    

Literatur

1. Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.

2. Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.

3. Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.