Faktoren, welche die Auflösung in der HPLC beeinflussen

• Funktionsweise der HPLC
• HPLC-Auflösung Rs
• Auflösungsgleichung
• Totvolumen
• Retentionsfaktor k
• Selektivität oder Trennfaktor α (alpha)
• Säuleneffizienz oder Anzahl theoretischer Böden N
• Gründe für eine reduzierte Säuleneffizienz
• Peaksymmetrie
• Säulensymmetrie, Asymmetriefaktor oder Tailing-Faktor
• Asymmetriefaktor As
• USP-Tailing-Faktor T
• Verbessern der Auflösung in der HPLC

Funktionsweise der HPLC

Der HPLC-Trennungsprozess beginnt, wenn eine Probe auf eine mit porösen Partikeln gefüllte Säule gegeben wird. Die Probe wird eingespritzt und von einer sich bewegenden flüssigen Phase (mobile Phase) durch die Säule transportiert. Wenn Analyten auf die stationäre Phase treffen, treten sie in unterschiedlichem Maße mit ihr in Wechselwirkung und trennen sich in reine Zonen, die analysiert oder gesammelt werden können. Analyten, die eine starke Affinität zur stationären Phase haben, bleiben länger auf der Säule.

HPLC-Auflösung R_s

Die Auflösung ist ein wichtiger Indikator für die Leistung der HPLC, der in der Regel daran gemessen wird, wie schnell und vollständig sich die Zielbestandteile in einer Probe trennen, während sie eine Säule passieren. Die Auflösung wird gemessen, indem die Differenz der Peak-Retentionszeiten durch die durchschnittliche Peakbreite dividiert wird. Die Auflösung kann auch in der Auflösungsgleichung als eine Kombination der Faktoren (Trennung, Effizienz und Rückhaltung) ausgedrückt werden, die diesen Wert beeinflussen.

Totvolumen

Bei fast allen HPLC-Verfahren ist für die Säulenauflösung eine Form der selektiven Rückhaltung durch die stationäre Phase erforderlich. Um zu ermitteln, ob eine Verbindung zurückgehalten wird, wird zunächst das Totvolumen V₀ der Säule berechnet, indem die Retentionszeit für einen nicht zurückgehaltenen gelösten Stoff bei einer bestimmten Fließrate gemessen wird.

Sobald das Totvolumen oder die Totvolumenzeit der Säule für eine bestimmte Fließrate bekannt ist, wird es/sie sich nicht mehr ändern. Eluiert ein gelöster Stoff in der Nähe oder direkt am Totpunkt, kann keine Auflösung durch die Wechselwirkung der stationären Phase erfolgen.

Abbildung 2. Auflösungsgleichung

Retentionsfaktor k

Der Retentionsfaktor wird manchmal auch als Kapazitätsfaktor bezeichnet. Es handelt sich um einen relativen Retentionsfaktor, in dem die Rückhaltung in Vielfachen der Zeit definiert wird, in der ein nicht zurückgehaltener Peak eluiert: t₀ oder t_M.  

In der Auflösungsgleichung ist t_R die Retentionszeit des Analyten und t₀ die Totzeit (manchmal auch t_M). Der Retentionsfaktor ist eine dimensionslose Kennzahl.

Der k-Wert für einen nicht zurückgehaltenen Peak ist 0. Ein k-Wert für einen Peak, der die gleiche Zeit in der stationären und der mobilen Phase verbringt, beträgt 1. Alle gelösten Stoffe verbringen die gleiche Zeit in der mobilen Phase und unterschiedlich viel Zeit in der stationären Phase. Das Säulentotvolumen im Umkehrphasenmodus wird in der Regel durch Injektion einer sehr polaren Verbindung wie Uracil oder Thioharnstoff bestimmt. Es gibt verschiedene Verfahren zur Bestimmung des tatsächlichen Totvolumens.

In den meisten Lehrbüchern wird empfohlen, dass alle Peaks von Interesse mit einem k-Wert von 1 oder höher zurückgehalten werden, damit eine zuverlässige Quantifizierung erreicht wird. Ein k-Wert von 2 bis 3 ist wünschenswert, wenn dieser erreicht werden kann. Ein k-Wert von mehr als 10 trägt kaum zur Verbesserung der Auflösung bei, verlängert die Analysezeit und verdünnt die Probe, sodass sie schwerer nachzuweisen ist.

Abbildung 3. Retentionsfaktor k

Selektivität oder Trennfaktor α (alpha)

Sobald v_M oder t_M bei einer bestimmten Fließrate für eine bestimmte Säule festgelegt ist, ändert sich dieser Wert nicht mehr. Die Selektivität oder der Trennfaktor α (alpha) wird aus dem Verhältnis der k-Werte für benachbarte Peaks berechnet. Der k-Wert für den späteren Peak wird immer in den Zähler gestellt, sodass die k-Werte immer gleich oder größer 1 sind.

Eine gute Selektivität für die HPLC liegt bei 1,1, wodurch eine Auflösung von 1,5 mit etwa 10.000 theoretischen Stellen erreicht werden kann. Das kritische Paar bei einer Trennung wird als benachbarte gelöste Stoffe definiert, die den kleinsten α-Wert aufweisen. Durch das kritische Paar wird die Mindestanzahl Böden definiert, die benötigt wird, um eine bestimmte Auflösung zu erreichen, wodurch wiederum die minimale Partikelgröße und Säulenlänge definiert wird.  

Säuleneffizienz oder Anzahl theoretischer Böden N

Die Säuleneffizienz, die Rate der Zonenspreizung, die durch das Verhältnis von Retentionszeit zu Peakbreite und dessen Quadrierung gemessen wird, wird in der Regel als N ausgedrückt. Wird die Peakbreite auf halber Höhe gemessen, beträgt die Konstante 5,54. Wird die Peakbreite an der Basis gemessen, muss eine Konstante von 16 verwendet werden, um etwa den gleichen N-Wert zu erhalten.

Für eine valide Bestimmung der Säuleneffizienz müssen Retentionszeit und Peakbreite in den gleichen Einheiten gemessen werden.

Gründe für eine reduzierte Säuleneffizienz

• Die laminare Strömung oder der von der Rohrwand verursachte Widerstand kann zu einer Bandverbreiterung außerhalb des Säulenbetts führen. Durch zu viele Verbindungsrohre oder Rohre mit einem zu großen Durchmesser kann die beobachtete Auflösung erheblich verringert werden.
• Mischkammerauswirkungen. Ein offenes Rohr wird zu einem hervorragenden Mischer, wenn die Probe zu lange in dieser Umgebung bleibt. Dies hat den unerwünschten Effekt, dass sich N verringert und die Auflösung sinkt. Dieser Effekt kann minimiert werden, indem Verbindungen mit sehr kurzen Rohrstücken mit kleinem Innendurchmesser (ID) hergestellt werden. Bei Säulen mit geringem Innendurchmesser ist erhöhte Vorsicht geboten. Die Dispersion der Zusatzsäule ist häufig ein Bereich, in dem sich zwei HPLC-Systeme voneinander unterscheiden. Ein System wird in der Regel eine höhere Effizienz bei Einsatz der gleichen Säule aufweisen, weil sie über einen effizienteren (kürzeren/engeren) Fließweg vom Injektor durch die Säule zum Detektor verfügt.
• Wirbelströmungen mit starken Richtungswechseln, Änderungen des Innendurchmessers und Unregelmäßigkeiten oder Grate im Strömungsweg tragen ggf. zu einer geringeren Säuleneffizienz bei.

Peaksymmetrie

Die Peaksymmetrie wirkt sich auch auf die Säuleneffizienz und damit auf die Auflösung aus. Stark absorbierende oder aktive Stellen sind häufig die Ursache für Tailing-Peaks. Säulen können eine hohe Effizienz und Auflösung bei neutralen gelösten Stoffen und eine sehr schlechte Effizienz und Auflösung bei Basen oder Säuren aufweisen, wenn aktive Stellen dieser Art vorhanden sind.

Ein Tailing von gelösten Stoffen wird als Peakverbreiterung mit einer erweiterten rechten Hälfte des Peaks angegeben. Eine übermäßige Säulenaktivität für einen gelösten Stoff ist nicht unbedingt ein Merkmal für eine ältere Säule, die stationäre Phase verloren hat. Dies kann auch bei neuen Säulen beobachtet werden, bei denen die Phasenchemie nicht für diese Probenart und Betriebsbedingungen optimiert wurde.

Säulensymmetrie, Asymmetriefaktor oder Tailing-Faktor

Asymmetriefaktor A_s

Die Normungsorganisation ASTM International empfiehlt die Berechnung der Säulensymmetrie oder -asymmetrie (A_s) als das Vor-/Rückverhältnis eines zweigeteilten Peaks, gemessen auf 10 % der Peakhöhe.

USP-Tailing-Faktor T

Ein Tailing-Peak hat eine Front von mehr als 1,0, während ein Fronting-Peak über eine Front von weniger als 1,0 verfügt. In der U.S. Pharmakopöe (USP) wird außerdem die Messung des Tailing-Faktors (T) als das Vor-/Rückverhältnis eines zweigeteilten Peaks, gemessen bei 5 % der Peakhöhe, empfohlen. Das Verhältnis ergibt sich durch das Teilen der Gesamtbreite durch die doppelte Breite der Frontseite.

Asymmetrie vs. USP Tailing-Faktor

Beide Berechnungsmethoden ergeben den gleichen Wert von 1 für einen symmetrischen Peak. In der USP-Methode werden jedoch niedrigere Werte für Tailing und Fronting angegeben als in der ASTM-Methode. Bei Einsatz eines automatischen Verfahrens für die Berechnung der Symmetrie, wird zunächst im Datensystem überprüft, welches Verfahren eingesetzt wird. In vielen Datensystemen sind beide Berechnungsverfahren verfügbar.

Verbessern der Auflösung in der HPLC

Verbessern von N (Effizienz) durch:

• Erweitern der Säulenlänge
• Verkleinern der Partikelgröße
• Verringern des Peak-Tailing
• Temperatursteigerung
• Reduzierung des Volumens der zusätzlichen Säule des Systems

Ändern von α (Selektivität) in:

• Ändern der stationären Phase der Säule
• Ändern des pH-Werts der mobilen Phase
• Ändern der/des Lösungsmittel(s) der mobilen Phase

Erhöhen von k (Retention) durch:

• Verwenden eines schwächeren Lösungsmittels (Änderung der Polarität)
• Ändern der Ionisierung (Polarität) des Analyten durch Änderung des pH-Werts
• Verwenden einer stärkeren stationären Phase (Änderung der Polarität)

Hinweise zur Auflösung:

• Wenn die Probe mehrere Peaks enthält, wird die Analyse in der Regel für das kritische Paar durchgeführt.
• Damit die Säule überhaupt funktionieren kann, müssen alle zu analysierenden Peaks erhalten bleiben. Durch Arbeiten in der Nähe der Lösungsmittelfront erhöht sich die Gefahr einer Co-Elution.

Viele der auf dieser Seite vorgestellten Informationen wurden ursprünglich in der Webinar-Reihe „HPLC Column Fundamentals“ von Dr. Richard A. Henry, einem emeritierten Professor für analytische Chemie der Pennsylvania State University, vermittelt, dem große Bedeutung im Bereich der Trenntechnik beigemessen wird.