Assays zur Bestimmung der Enzymaktivität
Enzymaktivitätsassays werden von Wissenschaftlern vorwiegend durchgeführt, um das Vorhandensein oder die Quantität eines spezifischen Enzyms in einem Organismus, in Gewebe oder in einer Probe zu bestimmen. Beispiele solcher Enzyme sind α-Amylase, Katalase, Laccase, Peroxidase, Lysozym und die Reporterenzyme alkalische Phosphatase und Luciferase. Verschiedene Reagenzien und Methoden für die Untersuchung spezifischer Enzym-Substrat-Interaktionen sind weit verbreitet verfügbar. Die Auswahl eines geeigneten Workflows hängt von der erforderlichen Empfindlichkeit ab. Kolorimetrische Lösungen eignen sich für den Nachweis, während fluoreszenzbasierte Reagenzien besser für die Quantifizierung der Enzymaktivität geeignet sind.
Bestimmung der optimalen Bedingungen für Enzymaktivität
Während in der Literatur zahlreiche Enzymassays beschrieben wurden, müssen diese Verfahren an die spezifischen Anforderungen des untersuchten Enzyms angepasst werden. Die spezifische Aktivität eines Enzyms hängt von zahlreichen Faktoren ab, wie z. B. pH-Wert, Temperatur, Ionenstärke und Konzentration aller Komponenten im Assay. Für Bedingungen wie dem pH-Wert sieht die Enzymaktivität oftmals wie eine Glockenkurve aus. Die höchste Aktivität bei einem spezifischen pH-Wert wird als Vmax angegeben, wobei die Aktivität auf beiden Seiten der Kurve abnimmt. Bei manchen Enzymen müssen auch Verbindungen berücksichtigt werden, die nicht direkt an der Reaktion beteiligt sind, wie z. B. Metallionen, Detergenzien und hydrophobe Moleküle.
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Komponenten von Enzymassays
Für viele Enzyme ist Wasser das Standard-Lösungsmittel, da es dem wasserbasierten Umfeld in Zellen entspricht. In manchen Fällen werden jedoch organische Lösungsmittel eingesetzt, wenn Enzyme oder Enzymkomponenten in Wasser unlöslich sind. Substrate und Cofaktoren, Katalysatoren für Enzymreaktionen, sind weitere wichtige Komponenten in einem Enzymaktivitätsassay. Substrate und Cofaktoren werden oftmals nach ihren Funktionen unter physiologischen Bedingungen identifiziert. Als solche interagieren Substrate und Cofaktoren umfassend und werden ggf. von unterschiedlichsten Enzymen benötigt. Puffer und Ionen sind weitere wichtige Elemente, die berücksichtigt werden müssen, da sie grundlegend für die Stabilisierung des pH-Werts während des gesamten Tests sind und die Enzymaktivität direkt beeinflussen. So können beispielsweise mono- oder divalente Metallionen für die katalytische Aktivität von Cofaktoren in der Reaktion erforderlich und grundlegend für die Enzymaktivität sein.
Durchführung eines Enzymassays
Die Vorbereitung der Enzymassaykomponenten ist ein praktischer erster Schritt. Es ist im Allgemeinen von Vorteil, eine große Assaymischung ohne Aktivierungskomponente herzustellen, um Pipettierfehler zu vermeiden, die mit dem Pipettieren kleiner Volumina verbunden sind. Nachdem die Assaymischung hergestellt wurde, wird die Aktivierungskomponente hinzugegeben, um den Aktivitätsassay zu starten. Eine Vorbehandlung des Enzyms durch Aufbewahrung bei kühlen Temperaturen und oftmals die Zugabe verschiedener Chemikalien oder Proteinadditive sind wichtige Faktoren, um die Enzymstabilität und maximale Aktivität vor dem Start des Assays zu gewährleisten. Sobald die Reaktionsmaterialien in einem Beobachtungsgefäß kombiniert wurden, sollten alle Komponenten schnell und gründlich gemischt werden, während die Reaktion einsetzt. Die Datenaufzeichnung sollte unmittelbar nach dem Mischen beginnen, und das detektierbare Signal des Assays sollte über die gesamte Reaktionsdauer aufgezeichnet werden.
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