Caracterización biofarmacéutica

Identidad

Determinación de masa intacta

La determinación de la masa molecular intacta, a menudo realizada con SEC-MS y los patrones apropiados, es una etapa necesaria en la caracterización de los productos biológicos, desde la selección de los clones hasta la verificación del producto final. El análisis de la masa molecular intacta se utiliza normalmente para demostrar la diversidad de las proteínas o péptidos producidos y verificar la identidad de los biofármacos. Con la optimización, puede determinarse también el peso molecular intacto de todas las proteínas producidas, entre ellas los anticuerpos monoclonales biespecíficos.

En lugar de tratar con la masa intacta difícil de manejar de una proteína biológica grande, se utiliza un enfoque de análisis de digestión de proteínas donde la muestra es escindida primero en sólo unos pocos fragmentos, después de lo cual la separación puede manipularse individualmente con patrones proteómicos especializados de espectrometría de masas.

Determinación de la cantidad

La productividad de la línea celular para suministrar cantidades suficientes de AcM influye en su potencial comercial. Utilizada como medición de referencia, la concentración se mide utilizando cromatografía de afinidad de proteína A (HPLC). En los inicios del desarrollo de los AcM, debían analizarse un gran número de muestras de cultivo celular recolectado (CHC) para determinar la concentración de IgG. Suele utilizarse la cromatografía de afinidad que emplea proteína A como ligando para determinar la concentración de AcM, así como para purificar los anticuerpos para el análisis de agregados y variantes de carga en etapas posteriores.

Análisis de aminoácidos

El análisis de aminoácidos es una forma popular de establecer la identidad del producto y se utiliza para determinar la composición de aminoácidos de un AcM. A menudo se realiza junto con una medición del coeficiente de extinción, un método empleado habitualmente para establecer el valor entre diferentes producciones.

Los materiales de referencia certificados con valores asignados por procedimientos válidos metrológicamente serán fundamentales para minimizar y controlar las variaciones experimentales en todas las etapas de la secuencia analítica de los aminoácidos, como la extracción, el fraccionamiento, el enriquecimiento, la proteólisis y el análisis de proteínas.

Cartografía peptídica

Para obtener una indicación de la identidad del AcM, puede ser suficiente la comparación de mapas peptídicos simples de enzimas individuales. Una caracterización más detallada de los anticuerpos terapéuticos, como la secuenciación N-terminal o C-terminal, la caracterización de glucanos y otros aspectos de la producción, el análisis, la purificación y la fragmentación de los anticuerpos, puede contribuir mejor a la ingeniería del producto. La espectrometría de masas proporciona información estructural añadida.

Modificación postraduccional

Análisis de n-glucanos:

La glucosilación muy variable puede afectar a la pureza del AcM y producir una función variable. Los anticuerpos monoclonales tienen N-glucanos en su esqueleto, que pueden liberarse utilizando LC-MS para evaluar los patrones de glucosilación. Es necesario caracterizar los N-glucanos de un anticuerpo monoclonal para proporcionar detalles estructurales completos de la molécula investigada. La comprensión de estas vías de N-glucano es importante porque los N-glucanos afectan a muchas propiedades de las glucoproteínas, como la conformación, la solubilidad, la antigenicidad y el reconocimiento por las proteínas de unión a glucanos.

Comparación de la estructura de orden superior (HOS) de los anticuerpos monoclonales (AcM)

Muchos factores influyen en la HOS, la estructura 3D de un AcM, que abarca desde la elección de la línea celular para la producción del AcM hasta las condiciones de bioprocesamiento, como la temperatura, el pH y la exposición a la luz. La espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno y deuterio (HDX-MS) es un método utilizado para obtener una visión detallada de la estructura terciaria del AcM.

Análisis de la modificación de los AcM

Pueden producirse muchas modificaciones postraduccionales diferentes durante el proceso de fabricación de los AcM, que están muy influidas por parámetros del proceso como medios o temperatura, entre otros. Para obtener un producto uniforme, es fundamental que estas modificaciones se reproduzcan durante cada ronda de síntesis de AcM. El análisis de las modificaciones incluye la cartografía de puentes disulfuro y la evaluación de la estructura glucano básica. También es aconsejable cuantificar la sialilación, ya que el ácido siálico puede tener un efecto negativo en el AcM.

Distribución de cargas de los AcM

Como consecuencia de las modificaciones postraduccionales (PTM) o las modificaciones químicas, las variantes de carga pueden tener un impacto considerable en la actividad biológica y la farmacocinética de un AcM. Un requisito normativo para los AcM, el análisis de la variante de carga puede evaluarse mediante técnicas como la cromatografía de intercambio catiónico (CEX) y el enfoque isoeléctrico capilar (cIEF).

Pruebas físicas y distribución del tamaño de los AcM

Análisis físicos de los AcM

Las pruebas físicas se utilizan para caracterizar el aspecto de un AcM, por ejemplo, la medición del pH, la osmolalidad y la concentración. La integridad del embalaje también se evalúa dentro del protocolo de pruebas físicas, utilizando el análisis de humedad de Karl Fischer o la entrada de colorantes para confirmar la integridad del precinto.

Distribución del tamaño de los AcM

Si bien lo que se desea es producir un único tipo de AcM, el material de producción inicial a menudo contiene variantes de tamaño como agregados, fragmentos y biomoléculas con otras cadenas ligeras. Dado que tienen el potencial de afectar a la inmunogenicidad y la potencia, es importante controlar su presencia. La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es el método más utilizado para evaluar la distribución por tamaño. 

Esterilidad e impurezas

Impurezas proteicas de la célula anfitriona

Las impurezas proteicas de las células anfitrionas (HCP), presentes en concentraciones de ppm en los biotratamientos, constituyen un importante riesgo de inmunogenicidad porque pueden provocar una respuesta inmunitaria impredecible en los pacientes. Su naturaleza compleja y diversa las hace difíciles de detectar o controlar. La mayoría de las impurezas HCP se eliminan eficazmente en los procesos habituales de purificación subsiguientes, pero una pequeña población de HCP es particularmente difícil. Se han desarrollado líneas CHO desactivadas para una HCP difícil de eliminar, la lipoproteína lipasa, para mejorar la estabilidad de los polisorbatos en las formulaciones de anticuerpos monoclonales.

Control de los aditivos durante la fabricación

Durante el desarrollo y la fabricación de los AcM debe controlarse una amplia variedad de aditivos de fabricación, entre ellos los detergentes, la proteína A, los reactivos de transfección, los antibióticos, los antiespumantes y los factores de crecimiento.

Análisis microbiológico de los AcM

Se precisa una variedad de procedimientos de análisis microbiológico para el desarrollo y la fabricación farmacéuticos conformes a la normativa y a las GMP. Muchos AcM se producen en microorganismos para beneficiarse de sus rápidas tasas de crecimiento y sus grandes rendimientos, por lo que es fundamental controlar y supervisar la presencia de contaminantes microbianos. Un componente de la pared celular de las bacterias gramnegativas, las endotoxinas, produce respuestas que van desde fiebre y escalofríos hasta un choque séptico fatal, lo que hace que la detección del pirógeno (pruebas MAT in vitro) y la posterior retirada del AcM sea crucial y un requisito normativo. Los ensayos del grado de contaminación microbiana deben utilizarse durante todo el proceso de fabricación de AcM para controlar la presencia de contaminación microbiana potencialmente dañina. Los ensayos de esterilidad son también fundamentales para confirmar la integridad de la producción de los AcM.

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