Clonación y expresión
Expresión de proteínas recombinantes en células de mamífero
Los investigadores utilizan tecnologías de clonación y expresión génica en diversos campos para investigar una amplia variedad de cuestiones biológicas, entre ellas el conocimiento de la función de los genes, el análisis de las vías moleculares, el desarrollo embrionario, la investigación de enfermedades y el bioprocesamiento de productos biológicos y terapéuticos, por nombrar sólo unos pocos. Una vez identificados el gen o la secuencia génica, los investigadores deben elegir la mejor estrategia de clonado molecular y el sistema celular de expresión proteica en función de la necesidad específica de la aplicación. Para más información sobre la expresión génica utilizando la tecnología CRISPR, o el silenciamiento génico utilizando los reactivos RNAi, visite nuestra página de expresión génica y silenciamiento de los genes.
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Vectores de expresión proteica
Los plásmidos, o vectores de expresión proteica, son piezas circulares de ADN que contienen numerosos elementos funcionales para la clonación y la expresión de la proteína de interés. La selección del vector de expresión apropiado viene determinada en parte por el tipo de proteína, el organismo que expresará la proteína, y la aplicación específica y las cuestiones científicas que el investigador desea abordar. La gran variedad de vectores de expresión disponibles permite a los investigadores elegir qué elementos de clonación, selección de clon y expresión proteica son mejores para su estudio. Una vez seleccionados la secuencia génica de interés y el vector de expresión, normalmente los investigadores utilizan nucleasas para cortar con precisión el vector en sitios específicos con el fin de permitir la clonación en marco de la secuencia genética de interés y, en último término, su expresión en un organismo hospedador. Es importante destacar que los investigadores utilizarán normalmente células químicamente competentes y transformación bacteriana para albergar los plásmidos de ADN recombinante ya que son estables cuando se conservan congelados a -70° C.
Cómo transfectar las células
La transfección celular se refiere al proceso de introducir ADN o ARN o proteínas en células eucariotas. Los investigadores disponen de una variedad de tecnologías físicas, químicas y biológicas para llevar a cabo esta parte del proceso de expresión proteica. Métodos físicos, como la electroporación, o métodos químicos, como el fosfato de calcio (CaPi), la polietilenimina (PEI) y los reactivos de lipofección, son habitualmente utilizados por los investigadores. Sistemas de transducción vírica, como el lentiviral, el oncorretroviral y el adenoviral, también están a disposición de los científicos. Sin embargo, la utilización de métodos de introducción vírica suele requerir contención y supervisión añadidas por razones de bioseguridad.
Sistemas de expresión proteica
Los investigadores utilizan varios organismos para expresar su proteína de interés. Las bacterias son habitualmente utilizadas ya que captan con eficacia los vectores de expresión, tienen tiempos de duplicación rápidos y pueden producir elevadas cantidades de la proteína recombinante en condiciones óptimas. Sin embargo, dado que las bacterias son organismos procariotas, no pueden proporcionar las modificaciones postraduccionales que algunas proteínas requieren. Las células eucariotas, como las levaduras y las líneas celulares de mamífero, facilitan las modificaciones postraduccionales de las proteínas y son también habitualmente utilizadas por los investigadores. La elección de la mejor línea celular para la expresión de proteínas recombinantes y la estrategia de dicha expresión depende en gran medida de los requisitos específicos de la aplicación y de las cuestiones que el científico desee abordar.
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