Ottimizzazione per l'analisi ad alto rendimento dei cannabinoidi in una varietà di matrici con la colonna Ascentis® Express C18
Seamus Riordan-Short, Senior Chemist1, Yevgen Kovalenko, Technician1, Matthew Noestheden, Director of Operations1, Jennifer King, Program Marketing Manager2, Katherine K. Stenerson, Analytical Sciences Liaison2
1Supra Research and Development, 2Merck
Di pari passo con l'aumento delle normative concernenti cannabis e canapa, è andata crescendo anche la domanda di sviluppo e validazione di metodi analitici accurati e precisi per la determinazione della loro attività biologica. I cannabinoidi offrono una serie di difficoltà analitiche cui si aggiunge l'onere di dover trattare tante matrici diverse. La tecnica più comunemente utilizzata è l'HPLC/UV; per mantenere stabile la ritenzione e continuare a ottenere una buona separazione anche dopo molte iniezioni e con vari tipi di campione, è necessario ottimizzare i parametri dell’analisi in HPLC.
Gli scienziati della Supra Research and Development (“SupraRnD”) con sede a Kelowna, British Columbia, Canada (www.suprarnd.ca) hanno sviluppato un metodo per i cannabinoidi affidabile e ad alto rendimento, applicabile a molte matrici differenti. L'attività di SupraRnd nell'ambito delle analisi della cannabis è iniziata nel 2015 quando l'azienda ha ottenuto la specifica licenza da parte di Health Canada. Nel 2018 sono stati uno dei primi laboratori in Canada ad ottenere l'accreditamento ISO 17025 per i test della cannabis. Il loro metodo per la determinazione dell'attività biologica si è evoluto nel tempo al fine di soddisfare le mutevoli esigenze dei loro clienti ed è ora validato per svariate matrici.
Condizioni sperimentali
Campioni di fiori interi venivano congelati a -80 °C per un minimo di 30 minuti in sacchetti sigillati ermeticamente e subito dopo omogeneizzati.* Quando si analizzano i fiori di cannabis, è fondamentale omogeneizzare e subcampionare un campione rappresentativo, poiché si può osservare una notevole variabilità nelle concentrazioni di fitocannabinoidi tra piante diverse e anche nell'ambito di una determinata pianta. Successivamente il protocollo prevedeva una semplice estrazione con metanolo di un campione di 0,2 g, seguita da sonicazione e stabilizzazione dell'estratto a -20 °C per 1 ora. Il campione veniva quindi centrifugato e il surnatante diluito 100:1 per l'analisi in HPLC. La piccola dimensione del campione e la diluizione pre-analisi riducono al minimo la possibilità che la matrice causi problemi (ad es. interferenze, longevità della colonna, ecc.). L'analisi in HPLC ha una durata di 8 minuti da iniezione a iniezione. Ciò permette di effettuare 60 iniezioni in un intervallo di 8 ore, consentendo di eseguire più analisi in un solo turno di lavoro. I cannabinoidi analizzati con questo metodo sono elencati in Tabella 1.
Analisi dei cannabinoidi mediante HPLC
I parametri HPLC definiti al termine dello studio di ottimizzazione sono riassunti in Tabella 2.
Nel corso dello sviluppo di questo metodo, si è tenuto conto dei seguenti fattori:
- risoluzione cromatografica di tutti i 17 composti
- tempo di ciclo (ovvero tempo di corsa più condizionamento) inferiore a 10 minuti totali
- metodo robusto con prestazioni costanti per
- più di 1.000 iniezioni con tempi di ritenzione stabili, e al contempo una buona forma dei picchi e una buona risposta
- compatibilità con diverse matrici come fiori, cioccolato, unguenti, oli, concentrati, ecc.
Taratura del metodo
La taratura veniva eseguita tra 0,01 µg/mL e 40 µg/mL. Per alcuni campioni è stato necessario operare un'elevata diluizione, per portarli all’interno di questo intervallo analitico. Per la taratura e lo spiking, venivano utilizzati materiali di riferimento certificati (CRM) Cerilliant®. I singoli CRM dei cannabinoidi alla concentrazione di 1 mg/mL (ad eccezione del CBLA la cui concentrazione era di 0,5 mg/mL) venivano diluiti, insieme alla soluzione dello standard interno, direttamente nel componente A della fase mobile, per preparare una soluzione madre dei 17 componenti a 40 µg/ ml. Questa soluzione madre veniva quindi diluita ulteriormente in una miscela 30:70 dei componenti A:B della fase mobile, per preparare le concentrazioni inferiori degli standard di taratura.
Colonna HPLC: Ascentis® Express C18
La colonna utilizzata per l'analisi HPLC era una colonna Ascentis® Express C18, 15 cm x 2,1 mm D.I, 2 µm. Le colonne Ascentis® Express contengono particelle Fused-Core® la cui struttura è detta superficialmente porosa, perché costituita da un nucleo solido circondato da un guscio poroso. La particolare struttura delle particelle offre una maggiore efficienza di separazione rispetto alle particelle completamente porose della stessa dimensione e consente di completare l'analisi in tempi più brevi con una contropressione inferiore rispetto agli approcci che utilizzano particelle più piccole (< 2 µm) completamente porose. Questa caratteristica delle colonne Ascentis® Express consente l'uso di particelle più grandi, il che le rende compatibili sia con i sistemi HPLC convenzionali, sia con quelli UHPLC. Per questo metodo, SupraRnD ha utilizzato un sistema UHPLC, sebbene con un'adeguata ottimizzazione dello strumento sia possibile ottenere una separazione efficace anche su sistemi convenzionali. In particolare, ciò richiede la minimizzazione della dispersione del sistema che può essere ottenuta riducendo la lunghezza del tubo e il diametro interno dell'ingresso e dell'uscita della colonna; inoltre, la cella a flusso dei rivelatori UV dovrebbe avere un volume < 5 µL.
Convalida e prestazioni del metodo
Prima di scegliere Ascentis® Express C18 per la convalida del metodo, SupraRnD ha testato altre sei colonne di altri produttori, simili per caratteristiche chimiche. La risoluzione cromatografica e un breve tempo di corsa sono stati ottenuti con diverse colonne, ma solo con la colonna Ascentis® Express C18 si è raggiunta la stabilità del tempo di ritenzione, specialmente per i cannabinoidi acidi. Ciò è ben visibile in Figura 1 dove sono rappresentati i cromatogrammi di uno standard di controllo all'iniezione n° 1 e all'iniezione n° 1140, tra le quali sono stati analizzati numerosi estratti del campione.
Figura 1.Standard di cannabinoidi su colonna Ascentis® Express C18; confronto tra l'iniezione n. 1 e l'iniezione n. 1140.
Il metodo che utilizza la colonna Ascentis® Express C18 è stato convalidato per diverse matrici, inclusi fiori di luppolo (come matrice surrogata della cannabis), olio di semi di canapa, concentrato di CBD e unguenti a uso topico. I recuperi con il luppolo variavano tra l'85 e il 115% in un intervallo di spiking compreso tra lo 0,05 e il 20% in peso. Una sintesi di questa validazione, e delle matrici esaminate, è riassunta in Tabella 3. I limiti di quantificazione del metodo (MRL) raggiunti per i cannabinoidi (ad eccezione di CBDV, CBG, CBD e CBC nel concentrato) erano tutti dello 0,05% in peso. La ripetibilità, come RSDr %, era < 4% per tutte le matrici. In un'ulteriore valutazione con i proficiency test il metodo è stato approvato per i campioni di fiori di cannabis e di olio di canapa.
*Recupero di CBD non quantificato a causa dei livelli elevati
**Recupero di Δ9-THC non quantificato a causa dei livelli elevati
ŦPer CBDV, CBG, CBD, CBC in questa matrice sono insorti problemi che hanno reso impossibile il calcolo del MRL
La Figura 2 mostra cromatogrammi di fiori di luppolo spiked all'1% p/p e allo 0,05% p/p (concentrazione corrispondente al MRL). Anche a questo livello di spiking così basso, dove l'interferenza della matrice era più evidente, tutti i 17 cannabinoidi erano distinguibili dai picchi di fondo e potevano essere analizzati. Le interferenze eluite dopo THCV e CBL erano probabilmente dovute a terpeni specifici presenti nel campione di luppolo. Questi picchi non venivano osservati nei fiori di cannabis. In un campione di unguento spiked allo 0,05% (MRL) (Figura 3) tutti i cannabinoidi venivano chiaramente rilevati.
Figura 2.Fiori di luppolo, spiked all'1% e al 0,05% con cannabinoidi.
Fiori di luppolo, spiking con 0,05% di cannabinoidi.
Figura 3.Unguento a base di estratto di cannabis, spiking allo 0,05% in peso.
Ad oggi sono state effettuate più di 1.550 iniezioni su una sola colonna Ascentis® Express C18. Come evidenziato da SupraRnD, finora non si è verificato un aumento significativo della contropressione della colonna o un deterioramento delle prestazioni. I dati sulla contropressione raccolti nel corso di tale utilizzo mostrano un incremento netto del 2%. Inoltre, i tempi di ritenzione si sono mostrati stabili, consentendo di identificare con maggiore sicurezza i picchi dei cannabinoidi nei campioni. Un esempio è illustrato in Figura 4 in cui si confrontano due diverse matrici, cioccolato fondente e fiori di cannabis. Entrambi i campioni contenevano quantità misurabili di Δ9-THC e la differenza dei tempi di ritenzione delle due matrici era minima.
Figura 4.Confronto del cromatogramma di campioni di cioccolato fondente e di fiori di cannabis (non spiked).
Conclusioni
Dopo aver valutato diverse colonne per HPLC, SupraRnD ha sviluppato un metodo robusto per l'analisi di 17 cannabinoidi in diverse matrici utilizzando la colonna Ascentis® Express C18 . Finora, il metodo è stato applicato con successo a cinque diversi tipi di campioni tra cui fiori, unguenti, cioccolato, concentrati e caramelle gommose. Per il metodo finale è stata scelta la colonna Ascentis® Express C18 in virtù della stabilità del tempo di ritenzione con la ripetizione delle analisi e per la sua capacità di mantenere costanti le prestazioni cromatografiche con i cannabinoidi. Inoltre, la colonna, ancora in uso, ha mostrato un aumento minimo della contropressione nel corso di più di 1.500 iniezioni.
* Dopo la pubblicazione di questi dati, SupraRnD ha eliminato la fase di congelamento e cominciato a omogeneizzare i fiori interi a temperatura ambiente, per ridurre il rischio di gonfiare il contenuto di umidità per via della condensazione dell’acqua atmosferica sui campioni freddi.
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