Ultrafiltrazione di nanoparticelle
- Purificazione e produzione di nanoparticelle
- Tecniche di ultrafiltrazione per la separazione, la purificazione e la concentrazione di nanoparticelle
- Selezione di membrane per applicazioni con nanoparticelle
- Conclusioni
- Prodotti correlati
- Bibliografia
Purificazione e produzione di nanoparticelle
Le particelle nano-dimensionali (NPs) hanno acquisito un ruolo di rilievo nelle soluzioni avanzate per il bioimaging, la biosensoristica (biosensing) il drug delivery mirato e il rilascio controllato di agenti terapeutici. Nella produzione di nanomateriali, la raccolta e la preparazione efficiente di nanoparticelle costituiscono un passaggio critico. Nella preparazione e nella purificazione delle nanoparticelle a valle della sintesi, il ricorso all’ultrafiltrazione (UF) è ampiamente diffuso (Figura 1)1. In passato, la filtrazione veniva condotta mediante strumenti di ultrafiltrazione pressurizzata (pUF). L’introduzione di tecniche di ultrafiltrazione centrifuga (cUF) ha reso possibile la preparazione e la purificazione di nanoparticelle condotta su volumi ridotti.
Figura 1.Applicazioni di ultrafiltrazione nella preparazione e nella purificazione di nanoparticelle.
Le nanoparticelle possono essere ottenute a partire da materiali organici e inorganici, polimeri o metalli. Una tale funzionalizzazione superficiale consente di ottenere biofunzioni specifiche e incrementa la biocompatibilità nelle applicazioni biologiche2. Le particelle nanomagnetiche, i punti quantici, le nanoparticelle metalliche, le nanoparticelle di silice e le nanoparticelle polimeriche sono importanti nel settore biomedico3. Numerose sono le tipologie di nanoparticelle che non possono essere impiegate tal quali dopo la fabbricazione. Le formulazioni a matrice acquosa possono contenere principio attivo libero che è necessario rimuovere. Le biomolecole, le sostanze chimiche e gli eventuali altri contaminanti derivanti da lisati, fluidi corporei, siero, tamponi, terreni e altri reagenti devono essere ulteriormente separati. Alcune di queste sostanze producono effetti nocivi nell’ambiente biologico in cui sono presenti3. È quindi essenziale ricorrere a metodi affidabili che consentano di concentrare, arricchire, lavare e purificare le nanoparticelle.
Tecniche di ultrafiltrazione per la separazione, la purificazione e la concentrazione di nanoparticelle
Per purificare, lavare e concentrare le nanoparticelle in base alle dimensioni è possibile fare ricorso a dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga. Le unità da ultrafiltrazione centrifuga Amicon® Ultra e Centricon® Plus, così come il sistema di purificazione Amicon® Pro, che consente lavaggio e concentrazione simultanei, possono essere usati per:
- La separazione e la purificazione delle nanoparticelle
- La concentrazione delle nanoparticelle
- L’arricchimento delle nanoparticelle
- La desalazione
- Lo scambio di tamponi
- Il lavaggio successivo alla funzionalizzazione
- La deplezione delle proteine più abbondanti
Per l’ultrafiltrazione pressurizzata (pUF) di volumi maggiori di campione, le celle con agitatore Amicon® possono essere utilizzate in abbinamento all’opportuna membrana filtrante Ultracel®. Le celle con agitatore Amicon® costituiscono un sistema di ultrafiltrazione delicata.
Dopo la filtrazione primaria, le nanoparticelle possono essere centrifugate ulteriormente in caso di lavaggio o di scambio di tamponi, o sottoposte nuovamente a concentrazione. I soluti trattenuti e quelli che sono passati possono essere raccolti ed analizzati per determinare la purezza delle nanoparticelle, l’efficienza dell’incapsulamento, il binding e la concentrazione del principio attivo.
Selezione di membrane per applicazioni con nanoparticelle
La separazione e la concentrazione delle molecole nel corso dell’ultrafiltrazione si basa sull’esclusione dimensionale. La grande maggioranza delle biomolecole è caratterizzata da un peso molecolare inferiore a 500.000 Da e le nanoparticelle rientrano a pieno titolo in questa categoria Le unità da ultrafiltrazione centrifuga Amicon® Ultra, le unità da ultrafiltrazione centrifuga per volumi maggiori Centricon® Plus e i sistemi di purificazione Amicon® Pro per il lavaggio e la concentrazione in simultanea sono caratterizzati da specifici limiti di esclusione del peso molecolare nominale (NMWL) definiti dal filtro a membrana impiegato, ad indicare una soglia dimensionale in corrispondenza della quale più del 90% delle particelle viene trattenuto. Questi sistemi di filtrazione sono disponibili con NMWL di membrana pari a 3.000, 10.000, 30.000, 50.000 e 100.000 Da. Per nanoparticelle di dimensioni specifiche e una specifica applicazione, la scelta di una membrana con pori della dimensione adatta può non essere facile, come messo in evidenza da un’indagine condotta sulla letteratura specialistica (Figura 2).
Figura 2.Confronto, per tipologia di nanoparticelle, tra le dimensioni delle membrane utilizzate (dati pubblicati). Occorre che la dimensione dei pori della membrana sia selezionata in base alla dimensione delle nanoparticelle e all’applicazione di interesse (per es. la purificazione da un campione complesso, la concentrazione, lo scambio di tamponi, la desalinizzazione).
Qui di seguito vengono esaminati i fattori da considerare quando si selezionano il metodo di ultrafiltrazione e la dimensione dei pori della membrana.
- Dimensione delle nanoparticelle: tale dimensione può essere stimata in base a dati pubblicati o mediante tecniche di misurazione quali la microscopia, la diffrazione laser e lo scattering dinamico della luce.
- Dimensione dei principali target della separazione in soluzione: la dimensione di proteine, anticorpi, principi attivi, sostanze chimiche o altre particelle che devono essere separate influenzerà la scelta della dimensione dei pori.
- Volume del campione: i volumi di processo compresi nell’intervallo tra 0,5 e 70 mL sono compatibili con i dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga. Volumi maggiori possono essere trattati più adeguatamente ricorrendo a dispositivi di ultrafiltrazione pressurizzata (pUF).
Per trattenere le nanoparticelle, la soglia di peso molecolare del filtro a membrana deve essere più piccola rispetto alla nanoparticella (~2 volte più piccola rispetto al peso molecolare dei questa), ma abbastanza grande da permettere alle componenti più piccole di passare attraverso il filtro.
Conclusioni
L’ultrafiltrazione centrifuga (cUF) e l’ultrafiltrazione pressurizzata (pUF) giocano un ruolo importante nella purificazione e nella preparazione delle nanoparticelle. Le applicazioni di ultrafiltrazione di nanoparticelle includono la separazione, la concentrazione, lo scambio di tamponi, il monitoraggio terapeutico del farmaco e la rimozione di coloranti, enzimi e componenti liberi derivanti dalla preparazione delle nanoparticelle. Molte sono le pubblicazioni che sottolineano l’utilità dei dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga Amicon® e Centricon® e delle celle con agitatore per l'ultrafiltrazione pressurizzata Amicon® nelle operazioni di purificazione e di concentrazione di nanoparticelle e macromolecole. Considerato che le impurezze possono essere di natura ionica, molecolare o particellare, la scelta ottimale del filtro può fare una notevole differenza quanto a rese, riproducibilità dei risultati e qualità del filtrato. I dispositivi di filtrazione Amicon® e Centricon® contengono un filtro a membrana in cellulosa rigenerata Ultracel® la cui struttura complessa rimuove dal campione tutte quelle impurezze che possono influire sulle determinazioni di carattere biologico e chimico, sulle analisi downstream e sull’esecuzione dei saggi. Le tecniche di ultrafiltrazione permettono di realizzare operazioni di separazione, lavaggio e arricchimento finalizzate alla preparazione di nanoparticelle su scala di laboratorio. Entrambi i processi di ultrafiltrazione centrifuga (cUF) e pressurizzata (pUF) forniscono soluzioni rapide, semplici ed efficienti per separare i nanomateriali da componenti solide di minori dimensioni e fluidi che passano nel filtrato. La composizione fisica, le dimensioni e la forma sono caratteristiche importanti da prendere in considerazione all’atto della scelta del filtro. Il portfolio Amicon® propone una gamma di membrane da ultrafiltrazione per la purificazione e la produzione di nanoparticelle.
Bibliografia
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