T4455

Proteasi TEV

• Sinonimo/i: P1 protease, TEVp, Tobacco Etch Virus protease, rTEV
• NACRES: NA.54
• UNSPSC Code: 12352204
• Specific activity: ≥3,000 units/mg protein
• Biological source: microbial (Tobacco Etch virus)
• Recombinant: expressed in E. coli

Proprietà

• biological source: microbial (Tobacco Etch virus)
• Quality Segment: 200
• recombinant: expressed in E. coli
• description: Contains both a histidine tag and a GST tag
• form: solution
• specific activity: ≥3,000 units/mg protein
• mol wt: 27 kDa
• technique(s): protein purification: suitable
• suitability: suitable for purification of HIS tagged recombinant proteins
• application(s): genomic analysis
• shipped in: wet ice
• storage temp.: −20°C

Descrizione

General description

La proteasi del virus etch del tabacco (TEV) è uno strumento utile a rimuovere i tag di fusione dalle proteine ricombinanti.

La proteasi TEV è un dominio catalitico ingegnerizzato della proteasi Nia del virus etch del tabacco. La proteasi TEV è una cisteina proteasi altamente specifica e appartiene alla famiglia della C4 peptidasi.

Una struttura modificata della proteasi TEV da 52 kDa che contiene i tag GST e di istidina per facilitare la rimozione con terreni di affinità per il glutatione o His-Select^®.

La proteasi TEV possiede un dominio catalitico (NIa) con un peso molecolare di 27 kDa. È unico nel suo essere altamente specifico e attivo a basse temperature.

Application

La proteasi TEV è stata usata per rimuovere il tag di istidina dalla protein chinasi ricombinante attivata da mitogeno 14 (MAPK14), dal frammento c-terminale della connessina 43 (Cx43) e dalla δ1-pirrolina-5-carbossilato reduttasi da Oryza sativa. È stata inoltre usata nell′eluizione di proteasomi purificati da linee cellulari della leucemia umana K562.

Biochem/physiol Actions

La proteasi TEV immobilizzata su steptavidina-agarosio è uno strumento efficiente per la scissione delle proteine di fusione. La proteasi TEV è stata usata anche in uno studio per esaminare il trattamento proteolitico di nlrp1b per l′attività dell′inflammasoma. [1]

La proteasi TEV ha una rigida sequenza di riconoscimento per la scissione di 7 aminoacidi: Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly/Ser.

La proteasi del virus etch del tabacco (TEV) subisce l′autolisi, ma le forme mutanti della proteasi TEV resistono all′autolisi. L′espressione batterica della proteasi TEV ricombinante dà luogo a una resa scarsa e a minore solubilità. L′uso della proteasi TEV con la proteina di fusione fluorescente verde supera questi ostacoli e trova applicazione nella ricerca sulla genomica strutturale.

Features and Benefits

Ingegnerizzata e purificata al meglio per una maggiore stabilità e un′elevata attività specifica in un ampio intervallo di temperature.

Physical form

Fornita come >=2 mg/mL in 25 mM di Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM di NaCl, 1 mM di TCEP e 50% di glicerolo

Soluzione acquosa con glicerolo

Preparation Note

Protocollo di scissione
Preparare un tampone di dialisi fresco. Il tampone di dialisi deve essere formulato in modo da ottimizzare la solubilità della proteina target e non deve contenere inibitori delle proteasi. Deve anche essere compatibile con i processi di purificazione a valle; per esempio, se dopo la scissione si utilizza una colonna HIS Select^® per rimuovere il tag-His, deve contenere una quantità minima di EDTA o di DTT.
Esempio di un tampone di dialisi idoneo: Tris-HCl 25 mM a pH 8,0, NaCl 150-500 mM, β-mercaptoetanolo 14 mM
Questa proteasi TEV mantiene la medesima attività in NaCl 150 mM di, in NaCl 500 mM e in imidazolo 400 mM.
Diluire il campione della proteina target con il tampone di dialisi in modo da raggiungere una concentrazione a 1-2 mg/mL. Questo passaggio è opzionale nel caso in cui la proteina target formi aggregati nel tampone di dialisi. Mettere da parte una piccola aliquota come campione di controllo per l′analisi mediante PAGE. Se si eluisce la proteina target dalla colonna HIS Select^® si può aggiungere EDTA alla concentrazione finale 0,5 mM, purché l'EDTA sia compatibile con la proteina.
Aggiungere la proteasi TEV fino a raggiungere un rapporto di 1:100 (p/p) tra proteasi e proteina target oppure 10.000 unità (1 mg) di proteasi TEV per 100 mg di proteina target. Non è necessario calcolare il rapporto molare. É possibile aggiungere la proteasi TEV direttamente alla proteina target. Non è necessario cambiare il tampone o diluire la proteasi TEV. Il rapporto ottimale deve essere determinato in modo empirico. Un rapporto proteasi/proteina target (p/p) tra 1:50 e 1:200 dovrebbe essere efficace per la maggior parte delle proteine target.
Dializzare con il tampone di dialisi a 4 °C per circa 16 ore. La dialisi viene impiegata per rimuovere l′imidazolo o il glutatione se al termine della scissione si usano colonne di affinità HIS Select^® o con glutatione per rimuovere il tag o la protesi TEV.
Di solito, 1 mg di proteasi TEV scinde >90% di 100mg di una proteina di controllo a 4 °C in 16 ore.

Other Notes

Una unità di proteasi TEV scinde >85% di 3 μg di substrato di controllo in un′ora a pH 8,0, a 30 °C.

Legal Information

HIS-Select is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Informazioni sulla sicurezza

• Classe di stoccaggio: 10 - Combustible liquids
• wgk: WGK 2
• flash_point_f: Not applicable
• flash_point_c: Not applicable