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Informazioni su questo articolo
NACRES:
NA.55
UNSPSC Code:
41106313
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sufficient for 100 reactions, sufficient for 200 reactions, sufficient for 50 reactions
feature
hotstart: no
manufacturer/tradename
Roche
packaging
pkg of 100 reactions (05091284001), pkg of 200 reactions (05081963001), pkg of 50 reactions (05081955001)
technique(s)
RT-PCR: suitable, RT-qPCR: suitable
input
purified RNA
detection method
probe-based
General description
Le trascrittasi inverse retrovirali comunemente usate per la sintesi di cDNA mostrano una percentuale maggiore di errori di altre DNA polimerasi impiegate in tecniche di analisi di acidi nucleici. Questa mancanza di accuratezza porta ad un numero significativo di scambi di basi o mutazioni che si propagano ulteriormente in successive reazioni PCR. Enzimi PCR ad alta fedeltà (con correzione) sono disponibili da tanti anni; la nuova trascrittasi Roche ad alta accuratezza è inoltre in grado di sintetizzare con alte rese cDNA di lunghezza piena.
Un alto tasso di mutazione è un carattere distintivo delle repliche retrovirali. Questo ha origine nel meccanismo della replicazione del genoma mediante trascrittasi inversa codificata da virus che converte l′RNA genomico del virus in un DNA a doppio filamento. Nel corso di questo processo la trascrizione inversa produce frequenti errori di replicazione. Una delle spiegazioni accettate di questa inaccuratezza è la mancanza di attività di esonucleasi della RT 3′-5′. L′alta percentuale intrinseca di errori delle trascrittasi inverse non è ottimale per tutta una serie di applicazioni diverse.
Un alto tasso di mutazione è un carattere distintivo delle repliche retrovirali. Questo ha origine nel meccanismo della replicazione del genoma mediante trascrittasi inversa codificata da virus che converte l′RNA genomico del virus in un DNA a doppio filamento. Nel corso di questo processo la trascrizione inversa produce frequenti errori di replicazione. Una delle spiegazioni accettate di questa inaccuratezza è la mancanza di attività di esonucleasi della RT 3′-5′. L′alta percentuale intrinseca di errori delle trascrittasi inverse non è ottimale per tutta una serie di applicazioni diverse.
Miscela enzimatica Transcriptor a trascrittasi inversa ad alta fedeltà per RT-PCR a due stadi di RNA fino a 14 kb.
Il componente principale del kit Transcriptor per sintesi cDNA ad alta fedeltà è la trascrittasi inversa ad alta fedeltà Transcriptor, una miscela di una trascrittasi ricombinante inversa e un enzima mediatore di correzione. La sinergia tra i due enzimi insieme è il motivo della capacità della miscela enzimatica di fare trascrizione inversa di stampi RNA con una fedeltà sette volte superiore se confrontata con altre trascrittasi inverse di uso comune.
Miscela enzimatica Transcriptor a trascrittasi inversa ad alta fedeltà per fare trascrizione inversa di stampi a 14 kb. Grazie all′alta stabilità termica di entrambi gli enzimi componenti e al sistema tampone ottimizzato in modo particolare, la trascrizione inversa è possibile a temperature fino a +55°C. Questo consente la trascrizione inversa di stampi ricchi in GC con alte strutture secondarie, senza dovere includere additivi che potrebbero influenzare negativamente l′accuratezza della reazione di trascrittasi inversa.
La trascrittasi inversa ricombinante inclusa nella miscela enzimatica è espressa in E. coli. L′enzima ha attività DNA Polimerasi diretta sull′RNA, attività DNA Polimerasi dipendente dal DNA, attività di srotolamento e attività di RNasi H che degrada l′RNA in ibridi RNA:DNA. L′ultimo fattore elimina la necessità di procedere ad un ulteriore stadio di incubazione di RNasi H dopo la trascrizione inversa riducendo tempi di reazione e costi.
Il kit Transcriptor per sintesi di cDNA ad alta fedeltà include tutti i reagenti necessari per le reazioni di filamenti singoli di cDNA. Per l′innesco si possono usare tre diversi sistemi di primer. Sono inclusi nel kit due primer per la sintesi di cDNA: primer esameri casuali e un primer oligo-ancorato(dT)18 . Quest′ultimo è concepito per legarsi all′inizio della coda poli(A) per generare cDNA di lunghezza piena e impedire l′innesco da siti interni della coda poli(A). Le estremità 5′ degli mRNA lunghi sono di frequente sottorappresentate per cui questo metodo di innesco è preferito nella maggior parte delle applicazioni. L′uso di primer esameri casuali consente l′innesco lungo tutta la lunghezza dell′RNA per ottenere una rappresentazione uniforme di tutte le sequenze RNA e porta a trascrizione inversa di RNA che non hanno code poli(A). L′inibitore termostabile Protector di RNasi (facente parte del kit) protegge l′RNA dalla degradazione ad alte temperature di reazione.
Il componente principale del kit Transcriptor per sintesi cDNA ad alta fedeltà è la trascrittasi inversa ad alta fedeltà Transcriptor, una miscela di una trascrittasi ricombinante inversa e un enzima mediatore di correzione. La sinergia tra i due enzimi insieme è il motivo della capacità della miscela enzimatica di fare trascrizione inversa di stampi RNA con una fedeltà sette volte superiore se confrontata con altre trascrittasi inverse di uso comune.
Miscela enzimatica Transcriptor a trascrittasi inversa ad alta fedeltà per fare trascrizione inversa di stampi a 14 kb. Grazie all′alta stabilità termica di entrambi gli enzimi componenti e al sistema tampone ottimizzato in modo particolare, la trascrizione inversa è possibile a temperature fino a +55°C. Questo consente la trascrizione inversa di stampi ricchi in GC con alte strutture secondarie, senza dovere includere additivi che potrebbero influenzare negativamente l′accuratezza della reazione di trascrittasi inversa.
La trascrittasi inversa ricombinante inclusa nella miscela enzimatica è espressa in E. coli. L′enzima ha attività DNA Polimerasi diretta sull′RNA, attività DNA Polimerasi dipendente dal DNA, attività di srotolamento e attività di RNasi H che degrada l′RNA in ibridi RNA:DNA. L′ultimo fattore elimina la necessità di procedere ad un ulteriore stadio di incubazione di RNasi H dopo la trascrizione inversa riducendo tempi di reazione e costi.
Il kit Transcriptor per sintesi di cDNA ad alta fedeltà include tutti i reagenti necessari per le reazioni di filamenti singoli di cDNA. Per l′innesco si possono usare tre diversi sistemi di primer. Sono inclusi nel kit due primer per la sintesi di cDNA: primer esameri casuali e un primer oligo-ancorato(dT)18 . Quest′ultimo è concepito per legarsi all′inizio della coda poli(A) per generare cDNA di lunghezza piena e impedire l′innesco da siti interni della coda poli(A). Le estremità 5′ degli mRNA lunghi sono di frequente sottorappresentate per cui questo metodo di innesco è preferito nella maggior parte delle applicazioni. L′uso di primer esameri casuali consente l′innesco lungo tutta la lunghezza dell′RNA per ottenere una rappresentazione uniforme di tutte le sequenze RNA e porta a trascrizione inversa di RNA che non hanno code poli(A). L′inibitore termostabile Protector di RNasi (facente parte del kit) protegge l′RNA dalla degradazione ad alte temperature di reazione.
Application
Il kit per sintesi cDNA ad alta fedeltà Transcriptor è stato progettato per la trascrizione inversa di RNA con fedeltà superiore se confrontata con altre trascrittasi inverse. Il kit Transcriptor consiste in trascrittasi inversa ad alta fedeltà, una miscela di una trascrittasi ricombinante inversa e un enzima mediatore di correzione ottimizzati per RT-PCR a doppio stadio, per cui diventa il prodotto di elezione per:
Il kit è anche testato per strumenti LightCycler® e altri strumenti per PCR in tempo reale, perciò il prodotto risulta ideale anche per applicazioni quantitative di RT-PCR che richiedono alta fedeltà.
Il kit contiene tutti i componenti necessari per la sintesi di cDNA adatto per essere usato direttamente in RT-PCR qualitativa su termociclatori convenzionali o RT-PCR quantitativa su strumenti PCR in tempo reale. La confezione di 50 reazioni comprende anche 10 reazioni di controllo (miscela di RNA e primer di controllo).
- Clonare geni di interesse
- Sequenziare trascriptomi
- Generare librerie cDNA con inserti grandi e di lunghezza piena
- Generare analisi di espressione genica, come l′analisi della rimozione (splicing) dell′RNA.
Il kit è anche testato per strumenti LightCycler® e altri strumenti per PCR in tempo reale, perciò il prodotto risulta ideale anche per applicazioni quantitative di RT-PCR che richiedono alta fedeltà.
Il kit contiene tutti i componenti necessari per la sintesi di cDNA adatto per essere usato direttamente in RT-PCR qualitativa su termociclatori convenzionali o RT-PCR quantitativa su strumenti PCR in tempo reale. La confezione di 50 reazioni comprende anche 10 reazioni di controllo (miscela di RNA e primer di controllo).
Features and Benefits
Aumentare l′accuratezza durante le reazioni di trascrizione inversa.
Combinare accuratezza con alta sensibilità, alta resa e trascrizioni di piena lunghezza.
Ottenere risultati più rapidamente.
- Trarre vantaggio da una miscela enzimatica ottimizzata che garantisce una fedeltà 7 volte maggiore in confronto ad altre trascrittasi inverse comunemente usate.
- Contare su dati veramente fedeli come testimoniato dal sequenziamento di parecchi milioni di basi con il sistema 20 sequenziatore del genoma.
Combinare accuratezza con alta sensibilità, alta resa e trascrizioni di piena lunghezza.
- Generare trascrizioni complete fino a 14 kb con i primer ancorati oligo (dT)18 inclusi nel kit .
- Ottenere rese eccellenti.
- Rivelare numeri bassi di stampi, trascrizione inversa da stampi RNA fino a 10 pg.
- Trascrivere un′ampia serie di stampi, anche i più difficili (ad es.: RNA ricchi di GC con alte strutture secondarie) a temperature fino a +55°C.
Ottenere risultati più rapidamente.
- Ridurre il tempo della reazione di trascrizione inversa anche fino a 10 minuti.
- Finisci per primo
Analysis Note
Ciascun lotto del kit è testato per quantificare l′attività di correzione e con qRT-PCR a doppio stadio per quantificare la presenza di PBGD mRNA nell′RNA totale da cellule K-562.
Other Notes
Figura 1: L′accuratezza della trascrittasi inversa ad alta fedeltà Transcriptor e una trascrittasi inversa M-MuLV di uso comune.
Il tasso di errore è stato determinato usando il Sistema 20 sequenziatore di genoma. L′RNA è stato sottoposto a trascrittasi inversa con la trascrittasi inversa ad alta fedeltà Transcriptor e una trascrittasi inversa M-MuLV di uso comune. Dopo purificazione del cDNA e amplificazione con una polimerasi a correzione si è calcolato il tasso di errore delle trascrittasi inverse sottraendo l′errore della PCR di controllo eseguita con plasmide DNA con la stessa sequenza. Il tasso di errore di Transcriptor con trascrittasi inversa ad alta fedeltà è la media di quattro esperimenti indipendenti in cui si sono sequenziate almeno 3,1 x 106 basi. Per la trascrittasi inversa M-MuLV sono state sequenziate 4,5 x 106 basi.
L′accuratezza è descritta come tasso d′errore -1, il numero medio di basi che hanno subito trascrizione inversa con successo prima che sia avvenuto il primo errore di trascrizione. Transcriptor a trascrittasi inversa ad alta fedeltà mostra superiore accuratezza rispetto ad una trascrittasi inversa M-MuLV standard, dando come risultato un tasso di errore inferiore nella sintesi del cDNA.
Il tasso di errore è stato determinato usando il Sistema 20 sequenziatore di genoma. L′RNA è stato sottoposto a trascrittasi inversa con la trascrittasi inversa ad alta fedeltà Transcriptor e una trascrittasi inversa M-MuLV di uso comune. Dopo purificazione del cDNA e amplificazione con una polimerasi a correzione si è calcolato il tasso di errore delle trascrittasi inverse sottraendo l′errore della PCR di controllo eseguita con plasmide DNA con la stessa sequenza. Il tasso di errore di Transcriptor con trascrittasi inversa ad alta fedeltà è la media di quattro esperimenti indipendenti in cui si sono sequenziate almeno 3,1 x 106 basi. Per la trascrittasi inversa M-MuLV sono state sequenziate 4,5 x 106 basi.
L′accuratezza è descritta come tasso d′errore -1, il numero medio di basi che hanno subito trascrizione inversa con successo prima che sia avvenuto il primo errore di trascrizione. Transcriptor a trascrittasi inversa ad alta fedeltà mostra superiore accuratezza rispetto ad una trascrittasi inversa M-MuLV standard, dando come risultato un tasso di errore inferiore nella sintesi del cDNA.
Figura 2: Confronto di varie trascrittasi inverse per la trascrizione inversa di RNA totale per frammenti di diverse dimensioni.
RNA totale (1 μg da RNA totale da muscolo umano per il frammento 2,3 kb; 1 μg da RNA totale HeLa per i frammenti 5,4 kb e 9,4 kb; 2 μg di RNA totale da cervello di topo per il frammento 12,4 kb) sono stati sottoposti a trascrizione inversa con diverse trascrittasi inverse seguendo le raccomandazioni dei produttori′ . Aliquote di 5 μL di ciascuna reazione cDNA sono state amplificate con dNTPack ‘Roche′ad espansione a largo raggio. I risultati dimostrano che il kit Transcriptor per sintesi cDNA ad alta fedeltà trascrive un′ampia gamma di dimensioni di frammenti con rese e specificità superiori in confronto alle trascrittasi inverse di altri fornitori.
RNA totale (1 μg da RNA totale da muscolo umano per il frammento 2,3 kb; 1 μg da RNA totale HeLa per i frammenti 5,4 kb e 9,4 kb; 2 μg di RNA totale da cervello di topo per il frammento 12,4 kb) sono stati sottoposti a trascrizione inversa con diverse trascrittasi inverse seguendo le raccomandazioni dei produttori′ . Aliquote di 5 μL di ciascuna reazione cDNA sono state amplificate con dNTPack ‘Roche′ad espansione a largo raggio. I risultati dimostrano che il kit Transcriptor per sintesi cDNA ad alta fedeltà trascrive un′ampia gamma di dimensioni di frammenti con rese e specificità superiori in confronto alle trascrittasi inverse di altri fornitori.
Figura 3: Confronto di diversi tempi di incubazione per reazioni di cDNA, usando il kit di sintesi Transcriptor High Fidelity cDNA.
Un microgrammo di RNA totale da HeLa è stato sottoposto a trascrizione inversa a +50°C secondo i tempi indicati. Aliquote di 5 microlitri delle reazioni cDNA sono state amplificate con primer per un frammento da 8.5 kb, usando il dNTPack Roche per espansione a largo raggio. Tutte le reazioni portate avanti in duplicato. I risultati dimostrano che il kit Transcriptor per sintesi cDNA ad alta fedeltà trascrive in modo efficiente l′RNA con alta velocità ed accuratezza.
Un microgrammo di RNA totale da HeLa è stato sottoposto a trascrizione inversa a +50°C secondo i tempi indicati. Aliquote di 5 microlitri delle reazioni cDNA sono state amplificate con primer per un frammento da 8.5 kb, usando il dNTPack Roche per espansione a largo raggio. Tutte le reazioni portate avanti in duplicato. I risultati dimostrano che il kit Transcriptor per sintesi cDNA ad alta fedeltà trascrive in modo efficiente l′RNA con alta velocità ed accuratezza.
Figura 4: Confronto di diversi tempi di incubazione per reazioni di cDNA, usando il kit di sintesi cDNA Transcriptor alta fedeltà.
1 μg di RNA totale HeLa è stato sottoposto a trascrizione inversa a +50°C per i tempi indicati. Aliquote di 5 μL delle reazioni cDNA sono state amplificate con primer per un frammento di 8.5 kb, usando dNTPack ‘Roche′ad espansione a largo raggio. Tutte le reazione condotte in duplicato
1 μg di RNA totale HeLa è stato sottoposto a trascrizione inversa a +50°C per i tempi indicati. Aliquote di 5 μL delle reazioni cDNA sono state amplificate con primer per un frammento di 8.5 kb, usando dNTPack ‘Roche′ad espansione a largo raggio. Tutte le reazione condotte in duplicato
Esclusivamente per ricerche di life science. Non usare a scopo diagnostico.
Il kit Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis comprende:
* Incluso solo nella confezione da 50 reazioni.
- Transcriptor a trascrittasi inversa ad alta fedeltà (unione di una trascrittasi ricombinante inversa e un enzima mediatore di correzione)
- Tampone di reazione Transcriptor ad alta fedeltà, concentrato 5x
- Inibitore di RNasi Protector
- Miscela dNTP, grado PCR
- Primer oligo-ancorato (dT)18
- Primer esamero casuale
- DTT
- Acqua di grado PCR
- RNA di controllo – frazione totale di RNA purificato dalla linea cellulare immortale K-562*
- Miscela primer di controllo PBGD (primer diretto e inverso)*
* Incluso solo nella confezione da 50 reazioni.
Legal Information
LightCycler is a registered trademark of Roche
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|---|---|---|---|
| technique(s) RT-PCR: suitable, RT-qPCR: suitable | technique(s) RT-PCR: suitable, RT-qPCR: suitable | technique(s) RT-PCR: suitable, RT-qPCR: suitable | technique(s) PCR: suitable |
| detection method probe-based | detection method probe-based | detection method probe-based | detection method - |
| packaging pkg of 100 reactions (05091284001), pkg of 50 reactions (05081955001), pkg of 200 reactions (05081963001) | packaging pkg of 200 reactions (03531287001), pkg of 25 reactions (03531317001), pkg of 50 reactions (03531295001) | packaging pkg of 150 reactions (04655885001), pkg of 50 reactions (04655877001) | packaging kit of 1 (2 components) |
| manufacturer/tradename Roche | manufacturer/tradename Roche | manufacturer/tradename Roche | manufacturer/tradename Roche |
| feature hotstart: no | feature dNTPs included: no, hotstart: no | feature hotstart | feature High Fidelity PCR, dNTPs included, hotstart: no |
| usage sufficient for 100 reactions, sufficient for 50 reactions, sufficient for 200 reactions | usage sufficient for 25 reactions, sufficient for 50 reactions, sufficient for 500 reactions | usage sufficient for 150 reactions, sufficient for 50 reactions | usage sufficient for ≤200 reactions |
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