THIFICDNARO
Roche
Kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity
sufficient for 50 reactions, sufficient for 100 reactions, sufficient for 200 reactions, suitable for RT-PCR, suitable for RT-qPCR
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About This Item
Code UNSPSC :
41106313
Nomenclature NACRES :
NA.55
Produits recommandés
Utilisation
sufficient for 100 reactions
sufficient for 200 reactions
sufficient for 50 reactions
Niveau de qualité
Caractéristiques
hotstart: no
Fabricant/nom de marque
Roche
Conditionnement
pkg of 100 reactions (05091284001)
pkg of 200 reactions (05081963001)
pkg of 50 reactions (05081955001)
Technique(s)
RT-PCR: suitable
RT-qPCR: suitable
Entrée
purified RNA
Méthode de détection
probe-based
Description générale
Les transcriptases inverses rétrovirales couramment utilisées pour la synthèse de l′ADNc présentent un taux d′erreur plus élevé que les autres ADN polymérases utilisées dans les techniques d′analyse des acides nucléiques. Ce manque de précision entraîne un nombre important d′échanges de bases ou de décalages du cadre de lecture, qui sont propagés dans les réactions ultérieures de PCR. Les enzymes de PCR haute fidélité (correctrices) sont disponibles depuis de nombreuses années. La nouvelle transcriptase inverse haute précision de Roche permet en outre la synthèse de hauts rendements d′ADNc de taille complète.
Un taux de mutation élevé est caractéristique de la réplication des rétrovirus. Cela découle du mécanisme de réplication du génome par la transcriptase inverse encodée par le virus, qui convertit l′ARN génomique du virus en ADN double brin. Au cours de ce processus, la transcription inverse produit des erreurs de réplication fréquentes. Une explication de ce manque de précision est l′absence d′activité exonucléase 3′-5′ de la transcriptase inverse. Le taux d′erreur naturellement élevé des transcriptases inverses n′est pas optimal pour de nombreuses applications différentes.
Un taux de mutation élevé est caractéristique de la réplication des rétrovirus. Cela découle du mécanisme de réplication du génome par la transcriptase inverse encodée par le virus, qui convertit l′ARN génomique du virus en ADN double brin. Au cours de ce processus, la transcription inverse produit des erreurs de réplication fréquentes. Une explication de ce manque de précision est l′absence d′activité exonucléase 3′-5′ de la transcriptase inverse. Le taux d′erreur naturellement élevé des transcriptases inverses n′est pas optimal pour de nombreuses applications différentes.
Mélange d′enzymes de transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity, pour une RT-PCR à deux étapes haute fidélité, adaptée à l′ARN jusqu′à 14 kb.
Le constituant au cœur du kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity est la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity, un mélange d′une transcriptase inverse recombinante et d′une enzyme correctrice. La synergie qui existe entre les deux enzymes permet à ce mélange enzymatique de catalyser la transcription inverse de matrices ARN en multipliant la fidélité par sept par rapport aux autres transcriptases inverses couramment utilisées.
Le mélange d′enzymes de transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity permet une transcription inverse efficace des matrices de 14 kb maximum. Grâce à la thermostabilité élevée des deux constituants enzymatiques et du système de tampons spécialement optimisé, il est possible de mener la transcription inverse à une température jusqu′à +55 °C. Cela favorise la transcription inverse des matrices riches en GC et en structures secondaires, sans nécessiter d′additifs qui peuvent avoir une influence négative sur la précision de la réaction.
La transcription inverse incluse dans ce mélange d′enzymes est exprimée chez E. coli. Cette enzyme possède une activité d′ADN polymérase ARN-dépendante, d′ADN polymérase ADN-dépendante, de déroulement de l′ADN et de RNase H qui dégrade l′ARN présent sous forme d′hybrides ADN:ARN. Cette dernière activité élimine le besoin d′ajouter une étape longue d′incubation à la RNase H à l′issue de la transcription inverse, ce qui réduit le temps de réaction et le coût.
Le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity fournit tous les réactifs nécessaires pour les réactions de synthèse du premier brin d′ADNc. Trois systèmes d′amorces différents peuvent être utilisés pour l′amorçage. Deux amorces de synthèse de l′ADNc sont fournies dans le kit : un mélange d′hexamères aléatoires et une amorce ancrée oligo (dT)18. Cette dernière est conçue pour se lier au début de la queue poly(A) des ARN messagers pour former des ADNc de taille complète et pour éviter l′amorçage sur des sites internes de la queue poly(A). Comme les extrémités 5′ des ARNm de grande taille sont souvent présentes en plus faibles quantités, cette méthode d′amorçage est préférée pour la plupart des applications. L′utilisation d′hexamères aléatoires permet un amorçage tout au long de l′ARN pour obtenir une représentation uniforme de toutes les séquences d′ARN et permet la transcription inverse des ARN dépourvus de queue poly(A). L′inhibiteur de RNases thermostable Protector (inclus dans ce kit) protège l′ARN contre la dégradation à des températures de réaction élevées.
Le constituant au cœur du kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity est la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity, un mélange d′une transcriptase inverse recombinante et d′une enzyme correctrice. La synergie qui existe entre les deux enzymes permet à ce mélange enzymatique de catalyser la transcription inverse de matrices ARN en multipliant la fidélité par sept par rapport aux autres transcriptases inverses couramment utilisées.
Le mélange d′enzymes de transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity permet une transcription inverse efficace des matrices de 14 kb maximum. Grâce à la thermostabilité élevée des deux constituants enzymatiques et du système de tampons spécialement optimisé, il est possible de mener la transcription inverse à une température jusqu′à +55 °C. Cela favorise la transcription inverse des matrices riches en GC et en structures secondaires, sans nécessiter d′additifs qui peuvent avoir une influence négative sur la précision de la réaction.
La transcription inverse incluse dans ce mélange d′enzymes est exprimée chez E. coli. Cette enzyme possède une activité d′ADN polymérase ARN-dépendante, d′ADN polymérase ADN-dépendante, de déroulement de l′ADN et de RNase H qui dégrade l′ARN présent sous forme d′hybrides ADN:ARN. Cette dernière activité élimine le besoin d′ajouter une étape longue d′incubation à la RNase H à l′issue de la transcription inverse, ce qui réduit le temps de réaction et le coût.
Le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity fournit tous les réactifs nécessaires pour les réactions de synthèse du premier brin d′ADNc. Trois systèmes d′amorces différents peuvent être utilisés pour l′amorçage. Deux amorces de synthèse de l′ADNc sont fournies dans le kit : un mélange d′hexamères aléatoires et une amorce ancrée oligo (dT)18. Cette dernière est conçue pour se lier au début de la queue poly(A) des ARN messagers pour former des ADNc de taille complète et pour éviter l′amorçage sur des sites internes de la queue poly(A). Comme les extrémités 5′ des ARNm de grande taille sont souvent présentes en plus faibles quantités, cette méthode d′amorçage est préférée pour la plupart des applications. L′utilisation d′hexamères aléatoires permet un amorçage tout au long de l′ARN pour obtenir une représentation uniforme de toutes les séquences d′ARN et permet la transcription inverse des ARN dépourvus de queue poly(A). L′inhibiteur de RNases thermostable Protector (inclus dans ce kit) protège l′ARN contre la dégradation à des températures de réaction élevées.
Application
Le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity est conçu pour catalyser la transcription inverse de l′ARN avec une fidélité accrue par rapport aux autres transcriptases inverses. Le kit inclut la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity, mélange d′une transcriptase inverse recombinante et d′une enzyme correctrice optimisé pour les RT-PCR à deux étapes, ce qui en fait le produit idéal pour :
Comme ce kit est également testé avec les appareils de PCR en temps réel comme le LightCycler® et autres, ce kit est idéal pour les applications de RT-PCR quantitative qui exigent une grande fidélité.
Ce kit contient tous les réactifs nécessaires pour la synthèse d′ADNc pouvant être utilisé directement dans les réactions de RT-PCR quantitative avec des thermocycleurs conventionnels ou de RT-PCR quantitative sur des appareils de PCR en temps réel. Le conditionnement pour 50 réactions comprend également 10 réactions de contrôle (mélange avec ARN de contrôle et amorce de contrôle).
- cloner les gènes d′intérêt
- séquencer les transcriptomes
- générer des banques d′ADNc avec des inserts longs, de taille complète
- générer une analyse d′expression génique, comme l′analyse de l′épissage de l′ARN
Comme ce kit est également testé avec les appareils de PCR en temps réel comme le LightCycler® et autres, ce kit est idéal pour les applications de RT-PCR quantitative qui exigent une grande fidélité.
Ce kit contient tous les réactifs nécessaires pour la synthèse d′ADNc pouvant être utilisé directement dans les réactions de RT-PCR quantitative avec des thermocycleurs conventionnels ou de RT-PCR quantitative sur des appareils de PCR en temps réel. Le conditionnement pour 50 réactions comprend également 10 réactions de contrôle (mélange avec ARN de contrôle et amorce de contrôle).
Caractéristiques et avantages
Augmentez la précision dans les réactions de transcription inverse.
Combinez la précision avec une haute sensibilité, un rendement élevé et des transcrits de taille complète.
Obtenez des résultats plus rapidement.
- Bénéficiez d′un mélange d′enzymes optimisé et multipliez la fidélité par sept par rapport aux autres transcriptases inverses couramment utilisées.
- Comptez sur des données réellement fiables, déterminées par séquençage de plusieurs millions de bases avec le système Genome Sequencer 20.
Combinez la précision avec une haute sensibilité, un rendement élevé et des transcrits de taille complète.
- Produisez des transcrits de taille complète jusqu′à 14 kb avec les amorces ancrées oligo (dT)18 incluses dans le kit.
- Obtenez d′excellents rendements.
- Détectez des matrices à faibles nombres de copies ; réalisez la transcription inverse à partir de 10 pg d′ARN matrice.
- Transcrivez diverses matrices, même les plus difficiles (p. ex., de l′ARN riche en GC et en structures secondaires) à des températures allant jusqu′à +55 °C.
Obtenez des résultats plus rapidement.
- Réduisez le temps de réaction de transcription inverse, à partir de 10 minutes.
- Terminez avant les autres.
Composants
Le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity inclut :
*Uniquement inclus dans le conditionnement à 50 réactions
- La transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity (mélange d′une transcriptase inverse recombinante et d′une enzyme correctrice)
- Tampon de réaction Transcriptor High Fidelity, concentré 5x
- Inhibiteur de RNases Protector
- Mélange de dNTP de qualité PCR
- Amorces ancrées oligo (dT)18
- Amorces aléatoires (hexamères)
- DTT
- Eau, de qualité PCR
- ARN de contrôle – fraction d′ARN total purifiée à partir de la lignée cellulaire K-562*
- Mélange d′amorces PBGD (sens et anti-sens)*
*Uniquement inclus dans le conditionnement à 50 réactions
Qualité
Chaque lot de kit subit des tests fonctionnels pour quantifier l′activité correctrice et des essais par qRT-PCR pour quantifier la présence d′ARNm de PBGD dans l′ARN total de cellules K-562.
Autres remarques
Figure 1 : Précision de la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity et d′une transcriptase inverse de M-MuLV couramment utilisée.
Le taux d′erreur a été déterminé par séquençage à l′aide du système Genome Sequencer 20. L′ARN a été transcrit en ADN avec la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity et une transcriptase inverse de M-MuLV couramment utilisée. Après purification de l′ADNc et son amplification avec une polymérase correctrice, le taux d′erreur des transcriptases inverses a été calculé en soustrayant le taux d′erreur du contrôle de PCR, réalisé à partir d′un plasmide portant la même séquence d′ADN. Le taux d′erreur de la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity est la valeur moyenne de quatre expériences indépendantes, dans lesquelles au moins 3,1 x 106 bases ont été séquencées. Dans le cas de la transcriptase inverse de M-MuLV, 4,5 x 106 bases ont été séquencées.
La précision est représentée comme le taux d′erreur -1, le nombre moyen de bases qui sont transcrites correctement avant l′apparition d′une seule erreur de transcription inverse. La précision de la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity est plus élevée que celle de la transcriptase inverse de M-MuLV, ce qui se traduit par un taux d′erreur plus faible lors de la synthèse de l′ADNc.
Le taux d′erreur a été déterminé par séquençage à l′aide du système Genome Sequencer 20. L′ARN a été transcrit en ADN avec la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity et une transcriptase inverse de M-MuLV couramment utilisée. Après purification de l′ADNc et son amplification avec une polymérase correctrice, le taux d′erreur des transcriptases inverses a été calculé en soustrayant le taux d′erreur du contrôle de PCR, réalisé à partir d′un plasmide portant la même séquence d′ADN. Le taux d′erreur de la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity est la valeur moyenne de quatre expériences indépendantes, dans lesquelles au moins 3,1 x 106 bases ont été séquencées. Dans le cas de la transcriptase inverse de M-MuLV, 4,5 x 106 bases ont été séquencées.
La précision est représentée comme le taux d′erreur -1, le nombre moyen de bases qui sont transcrites correctement avant l′apparition d′une seule erreur de transcription inverse. La précision de la transcriptase inverse Transcriptor High Fidelity est plus élevée que celle de la transcriptase inverse de M-MuLV, ce qui se traduit par un taux d′erreur plus faible lors de la synthèse de l′ADNc.
Figure 2 : Comparaison de différentes transcriptases pour la transcription inverse d′ARN total de différentes tailles.
L′ARN total (1 μg d′ARN total de muscle humain pour le fragment de 2,3 kb ; 1 μg d′ARN total de HeLa pour les fragments de 5,4 et 9,4kb ; 2 μg d′ARN total de cerveau de rat pour le fragment de 12,4 kb) a été traité par différentes transcriptases inverses, selon les recommandations du fabricant. Des aliquotes de 5 μl de chaque réaction d′ADNc ont été amplifiés à l′aide du Expand Long Range dNTPack de Roche. Les résultats indiquent que le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity permet la transcription efficace d′une vaste gamme de tailles de fragments avec un plus grand rendement et une spécificité plus élevée par rapport aux transcriptases inverses provenant d′autres fournisseurs.
L′ARN total (1 μg d′ARN total de muscle humain pour le fragment de 2,3 kb ; 1 μg d′ARN total de HeLa pour les fragments de 5,4 et 9,4kb ; 2 μg d′ARN total de cerveau de rat pour le fragment de 12,4 kb) a été traité par différentes transcriptases inverses, selon les recommandations du fabricant. Des aliquotes de 5 μl de chaque réaction d′ADNc ont été amplifiés à l′aide du Expand Long Range dNTPack de Roche. Les résultats indiquent que le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity permet la transcription efficace d′une vaste gamme de tailles de fragments avec un plus grand rendement et une spécificité plus élevée par rapport aux transcriptases inverses provenant d′autres fournisseurs.
Figure 3 : Comparaison de différents temps d′incubation des réactions d′ADNc à l′aide du kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity.
Un microgramme d′ARN total de cellules HeLa a été soumis à une transcription inverse à +50 °C pendant les temps indiqués. Des aliquotes de cinq microlitres des réactions d′ADNc ont été amplifiés avec des amorces correspondant à un fragment de 8,5 kb à l′aide du Expand Long Range dNTPack de Roche. Toutes les réactions ont été réalisées en double. Les résultats indiquent que le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity permet la transcription efficace, rapide et précise de l′ARN.
Un microgramme d′ARN total de cellules HeLa a été soumis à une transcription inverse à +50 °C pendant les temps indiqués. Des aliquotes de cinq microlitres des réactions d′ADNc ont été amplifiés avec des amorces correspondant à un fragment de 8,5 kb à l′aide du Expand Long Range dNTPack de Roche. Toutes les réactions ont été réalisées en double. Les résultats indiquent que le kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity permet la transcription efficace, rapide et précise de l′ARN.
Figure 4 : Comparaison de différents temps d′incubation des réactions d′ADNc à l′aide du kit de synthèse d′ADNc Transcriptor High Fidelity.
1 μg d′ARN total de cellules HeLa a été soumis à une transcription inverse à +50 °C pendant les temps indiqués. Des aliquotes de 5 μl des réactions d′ADNc ont été amplifiées avec des amorces correspondant à un fragment de 8,5 kb à l′aide du Expand Long Range dNTPack de Roche. Toutes les réactions ont été réalisées en double.
1 μg d′ARN total de cellules HeLa a été soumis à une transcription inverse à +50 °C pendant les temps indiqués. Des aliquotes de 5 μl des réactions d′ADNc ont été amplifiées avec des amorces correspondant à un fragment de 8,5 kb à l′aide du Expand Long Range dNTPack de Roche. Toutes les réactions ont été réalisées en double.
Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic.
Informations légales
LightCycler is a registered trademark of Roche
Mention d'avertissement
Warning
Mentions de danger
Conseils de prudence
Classification des risques
Eye Irrit. 2
Code de la classe de stockage
12 - Non Combustible Liquids
Classe de danger pour l'eau (WGK)
WGK 1
Point d'éclair (°F)
does not flash
Point d'éclair (°C)
does not flash
Certificats d'analyse (COA)
Recherchez un Certificats d'analyse (COA) en saisissant le numéro de lot du produit. Les numéros de lot figurent sur l'étiquette du produit après les mots "Lot" ou "Batch".
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